载体表达siRNA的基本步骤

(1) 合成模板

合成编码siRNA的DNA模板的两条单链，模板链后面接有RNA PolyII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamH I和Hind II 酶切位点，可以克隆到pSilencer2. 1-U6载体多克隆位点的BamH I和Hind II 酶切位点之间。

(2)合成编码siRNA的DNA双链退火
按照下列配制反应体系。

编码siRNA的DNA链1	2μg	ddH2O	45μL
编码siRNA的DNA链2	2μg	总体积	50μL
5mol/L NaCl	1μL

95℃，5min,缓慢退火，使DNA单链退火得到siRNA的DNA双链模板。

酶切表达siRNA载体

载体	2μg	Hind Ⅲ	1μL
10 Xbuffer	3μL	ddH2O	23μL
BamH Ⅰ	1μL	总体积	30μL

37℃，2-3h,利用试剂盒胶回收。

连接

T4DNA连接酶	5U	10 X 连接酶Buffer	1μL
线性化载体	2μL	加水补足	10μL
退火后编码 siRNA的DNA	2μL

选择载体和编码siRNA DNA的最佳比例，利用T4连接酶16℃连接4h或过夜。

(5)转化

①将100μL感受态细胞于冰上解冻。
②取5μL连接产物加人到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物，在冰上放置30min。
③将管放人预加温到42℃的水浴中，热激90s。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。
④每管中加700μL LB培养基，37℃ 振荡培养1h，进行复苏。
⑤室温3000r/min离心5min,弃去上清后，用剩余100μL培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意:细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。
⑥将平板置于室温直至液体被吸收。
⑦倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。

(6)PCR鉴定和测序鉴定

在插人编码shRNA的DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物，扩增片段在100-200bp之间，并可利用载体上的引物进行测序鉴定。

(7)转染细胞

载体可用常用的转染方法进行细胞转染。按照上述体外合成siRNA的方法进行转染。

(8)检测RNA干扰效率

可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下，蛋白质的表达变化与mRNA水平的表达变化一.致，也有少数情况下mRNA表达水平变化不及蛋白质表达下降明显。为检测蛋白质的表达情况，可以使用Western Blot。为检测mRNA表达情况，可以使用逆转录和实时定量PCR。

(9) 筛选稳定表达siRNA的克隆

在转染细胞1-3d后，利用载体携带的筛选标记如G418或puromycin进行筛选，杀死不含有siRNA表达载体的细胞，存活下来的是表达siRNA的细胞。

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