载体构建中的关键工具和实验步骤

一、关键工具

1、载体

    基因克隆最常用的载体是质粒，它们是在多种细菌中发现的环状DNA分子。质粒上有一个复制起始位点，它可以调控质粒的复制，并确保每个细菌中含有多个拷贝，且能随着细胞的分裂而分配到子细胞中。具体拷贝数取决于质粒的类型。只要目的基因是在一段有复制起始位点的DNA分子上，也就是说克隆到质粒上，当质粒被拷贝时，目的基因也就得到拷贝。

    用于基因克隆的质粒还有很多其他特性。原始状态的质粒可以很大，有的甚至大于100kb，但是用于常规基因克隆的质粒通常小于＜10kb,因为较小的质粒易于纯化和操作。用于克隆的质粒通常包含选择性标记，一般为抗生素抗性基因，这使得可以通过将细菌涂布在具有抗性的琼脂平板上来筛选含有质粒的细菌。这些包含质粒的细菌可以生长，最终形成一个可见的单克隆菌落，这个单克隆中所有的细菌都携带有质粒，因为所有不含有质粒的细菌都被抗生素杀死，而无法形成单克隆菌落。

2、限制性内切酶

     克隆基因需要对DNA进行位点特异性酶切。虽然DNA很容易断裂(比如摇晃就可以很快使DNA链断裂)，但对于基因克隆，需要以一种准确的、可重复的方式来切断DNA. 利用细菌自然产生的酶就可以做到这点，即使DNA在特定碱基序列处断裂。这些酶被称为限制性酶或者限制性内切酶，它们的命名是由其常见的功能衍生而来的。

    最常用的限制性内切酶之一便是大肠杆菌产生的EcoRI，它的识别序列为GAATTC,这意味着只要GAATTC序列一出现，它就可以切断DNA。需要注意的是，这个序列是反向重复的，也就是说，不论从5'到3'方向还是从3'到5'方向阅读该序列，结果是一样的。EcoR I将两条链都切断，并产生一个错开的末端，这就是所谓的黏性末端。这样就明白了为什么在将DNA片段连在一-起之前的酶切是如此重要。用限制性酶处理DNA所产生的DNA片段通常称作限制性片段。

    目前已经鉴定、表达并纯化出很多种限制性内切酶，它们的性能各不相同，各自可以识别不同的序列，这样的特征对于基因克隆都是有用的。

3、DNA连接酶

    上边介绍了切断DNA分子的方法，接下来将介绍一下如何将切断的DNA片段连接成一个新的分子，这个新的分子被称为重组体。当DNA分子被限制性内切酶如EcoRI等切开时，就会产生黏性末端，当两个具有相同黏性末端的分子相遇时，互补碱基之间的氢键就会使这两个分子相互接近，这也是为什么这些分子被称作“含有黏性末端”。由于“黏性末端”并不是一个很稳定的结构，两个分子也很快就会再次疏远，因此，在基因克隆时，需要这两个分子之间能够共价连接，形成具有稳定结构的连接体。把能够促成这个过程的酶称作DNA连接酶。

    欲使两个带有黏性末端的DNA片段通过氢键结合在一起，需要两个双链DNA分子上均含有缺口，而DNA连接酶可以修复这些单链缺口，它可以催化一条DNA链的5′端磷酸和另一条链的3端羟基形成磷酸二酯共价键。当然这个过程还需要能量的参与。最常用的DNA连接酶是T4连接酶，这是一种名为T4的噬菌体所产生的蛋白质。T4连接酶可以利用ATP作为能量来源。

4、PCR扩增反应

    PCR反应是在能够做热循环的机器(即PCR仪)，上完成的。这种仪器的固体金属块上可以放置能够进行PCR反应的一次性薄壁塑料管或者特制的96孔板。仪器所进行的反应是程序化的，可以在不同的温度下孵育并进行反复的循环。现代的机器能够运用压电加热和冷却系统，使得反应温度可以快速而且非常精确的变化，并不断地进行温度替换。一个典型的PCR反应体系由以下几个部分组成:一定量的DNA模板、DNA合成的原料, dNTP、引物以及Taq聚合酶。

    PCR反应中每个循环包括三个步骤:第一步，温度上升至92℃，使得两条DNA双链解离;第二步，温度降低到适合引物结合的温度，这个温度通常比引物的熔点低5℃，并且根据引物的不同而发生改变;第三步，温度上升到72℃，因为此时Taq聚合酶可以发挥最大功效，反应需要在72℃维持一.段时间，以便Taq聚合酶将新合成的DNA延伸完毕。这些步骤需重复30次左右，这期间DNA就会被大量复制，从而获得大量的扩增产物。

二、关键步骤

1、设计引物

    PCR引物是短的寡脱氧核苷酸，或者低聚物，被用来和PCR目标扩增物序列互补结合。这些合成的DNA通常是15~25核苷酸长度，同时含有50%~60%的G+C内含物。因为每个PCR引物会与目标序列的不同单链互补结合，引物序列彼此不能相关。事实上，需要特别注意的是，引物序列不能形成聚合结构，或者形成发夹环。3'端一定要和目标配对，以有效启动多聚合作用。引物5′端可能含有和目标序列并不互补的序列，如限制性内切酶酶切位点或者启动子也一起包含在PCR产物中。

    DNA双链中，一半分子呈单链而另一半分子呈双链时的温度被称为该复合物的T_m。因为分子间存在大量的氢键，高G+C含量DNA具有比低G+C含量DNA高的T_m。通常情况下，G+C含量可单独用来预测DNA双链的T_m，但是，具有相同G+C含量的DNA双链体也可能有不同的T_m值。一计算Tm的公式: T_m=4(G+C)+2(A+T)。

2、PCR扩增

(1)金属离子

    氯化镁是在PCR中DNA聚合酶的重要辅助因子，它的浓度对于每个引物来说必须进行优化。在PCR中，自由态的镁离子作为酶辅因子是必要的，所以总的镁离子浓度必须超过总dNTP的浓度。一个典型的例子是1. 5mmol/L氯化镁添加到存在0. 8mmol/L总dNTPs的PCR中。

(2)底物和底物类似物

    対于常規PCR, dNTPs的液度等摩尓比値保持平衡，比如，毎个dNTP 200umol/l。DNA聚合晦聚合dNTPs的效率比較高，当修怖的底物作カ朴充成分吋，聚合晦也能將其聚合，地高辛-dUTP、dUTP、c7deaza,dGTP和荧光标记的dNTPs均可作为聚合酶的底物。

(3)缓冲液和盐

要根据DNA聚合酶而用优化的PCR缓冲液浓度、盐浓度和pH。含有TaqDNA聚合酶的PCR缓冲液包含50mmol/L KCl和10mmol/L Tris•HCl，pH为8.3。

(4)增溶剂

     使用PCR增溶剂可以用来增加产物产量、提高扩增效率和PCR扩增的特异性。尽管某些增溶剂有利于促进扩增，但是并不可能对每个引物都有作用，因此，每次结合中的增溶剂都要进行实证分析。

(5) PCR反应管

PCR必须在具有良好热交换性质的容器内进行。通常情况下，PCR在10≈100μL的反应体积下进行，并且在热循环过程中，在封闭的反应管内需要避免蒸发/冷凝的过程，因此，可以采用矿物油或者蜡块封闭试管。

(6) PCR循环数

    PCR扩增在25~30个循环后，其产物产量的增长不是线性的，存在平顶曲线效应，该效应发生在产物积累的指数增长后的PCR反应期。这可能是由产物降解、反应物耗损、产物抑制、非特异性产物竞争等因素引起的。通常建议运行循环的最少数来检测希望的特异性产物;因为如果循环数过多，将会产生大量的非特异性产物。

3、酶切

    见“限制性内切酶”介绍部分。

4、连接

    连接是指将质粒和目的基因的限制性片段与T4连接酶-起混合，一个酶切后的质粒分子与一个酶切后的PCR产物片段发生连接，环化形成一个新的重组的分子。通过调整实验条件，可以有利于形成这种新的重组体。在稀释溶液中，载体分子两个末端自连的概率高于两个不同分子之间。连接反应中可以提高DNA片段的浓度，通常与载体片段的分子比为3:1(也就是说，加入载体分子数的三倍)，来增加正确重组体形成的概率。

5、转化

    基因克隆的最后一步就是将新的重组体导人到大肠杆菌体内，这个过程叫做转化，包含两步。首先要将重组的DNA导人到细菌内，接下来由于这是一个低效的过程，需要筛选出含有质粒的细菌。有一些细菌如淋病奈瑟菌可以从环境中接纳DNA,它们被称为具有自然转化的能力。而大肠杆菌不具备这种能力，大肠杆菌细胞需要被特殊的途径处理后才能使它们接纳DNA。有两种基本的方法将DNA导人到大肠杆菌中:化学转化和电转化。

6、鉴定

    连接和转化实验后，需要鉴定质粒中是否含有要插人的基因片段。通常情况下可以通过两种方式来完成。①对长出的克隆子直接进行PCR或提取质粒后再进行PCR。这两者的模板制作方法，前者是挑出克隆子至100μL 的水中，然后在沸水中煮沸10min 即可，后者是将克隆子接种到3~5mL的培养基中，提取质粒。然后再用目的基因的特异性引物或者载体的通用引物进行PCR扩增，如果出现合适大小的条带，说明筛选到正确的克隆子。②对克隆子进行提质粒，然后进行酶切鉴定。采用上述方法提取出克隆子中所包含的质粒后，采用酶切载体时所使用的两个限制性内切酶对质粒进行酶切，如果切下来的片段中除了含有质粒外，还包含另一个合适大小的片段，一般认为构建是成功的。

7、测序

     在初步鉴定后，还需要对载体进行进一步的测序，以确定目的片段是否正确地插人至载体中，以及是否发生了点突变等。在过去十年中，传统测序方法已经被自动测序所取代。现代的自动测序是采用四种荧光染料，每- -种针对一个dNTP。带有A的终止链由一种荧光染料所标记，带有T的终止链由第二种染料标记，带有G的终止链由第三种染料标记，带有C的终止链由第四种染料标记。使用四种不同的荧光染料标记，在单管中它能出现四个测序反应，在聚丙烯酰胺凝胶中的一个泳道加人一种反应混合物。荧光检测器扫描分离的条带，四个不同的荧光标记物之间辨别并翻译成为一一个颜色可读的色谱峰: A绿色，T红色，G黑色，C蓝色。多数情况下，单次运行的自动测序在普通实验室的研究最多可读取约600bp。

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