实验原理

    真核基因的表达调控是一个复杂的多级调控过程，包括染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译后水平等。染色质水平的调控包括组蛋白修饰、染色质重构等，转录水平的调节由顺式作用元件(即DNA序列)和反式作用因子(即转录因子)共同参与，二者通过直接或间接的相互作用调节基因的转录起始频率来调节基因的转录水平。转录后水平调节包括RNA剪接、micro RNA调节。基因的翻译后修饰包括泛素化、SUMO化、乙酰化、糖基化、磷酸化、甲基化、NEDD8修饰等，各种翻译后修饰的机制及功能各不相同。

    基因转录水平的调控在基因的表达调控过程中发挥着重要的作用，是影响基因表达水平的关键因素。因此，研究基因转录水平的调节机制一直就是基因表达调控研究领域的热点。研究一个基因的转录调节--般包括研究该基因启动子的活性、调节该基因的转录因子的活性和参与调节的转录共调节因子的活性。当对一个启动子开展分析时，主要目的是定量该启动;子的强度，往往需要将启动子克隆到外源载体上，为了区分来源于转染启动子的转录物和来源于内源基因的转录物，通常将启动子融合到异源基因的编码序列上。由于受到转染效率和;启动子可能较弱的限制，启动子通常需要和报告基因融合，以达到简便、快速、高效检测启动子强度的目的。检测一个转录因子对某段启动子的调节时，将含有该启动子调节的报告基:因载体和转录因子共转染细胞，通过检测报告基因的水平评价转录因子的功能，既能够定性地反映转录因子是否调节该启动子，又可以定量地评估转录因子的活性高低。如果与启动子共转染的是转录共调节因子，也可以通过检测报告基因的水平判断转录共调节因子的性质和活性。

    目前，有很多商业化的报告基因载体可用于基因的转录活性分析，例如Promega公司的PGL系列载体。

实验设计和基本步骤

    真核基因的转录调节包括启动子、转录因子、共调节因子三个组分，转录因子和转录共调节因子又称为反式作用因子，启动子为顺式作用元件。因此，研究基因的转录调节通常包括以下三种情况:①基因启动子的活性分析;②转录因子的活性分析;③转录共调节因子的活性分析。检测转录活性，一般需要同时转染一个内参报告基因作为内参，内参报告基因可以是海肾荧光素酶表达载体，也可以是β-半乳糖苷酶的表达载体，在此，以3-半乳糖苷酶作为内参报告基因。

1.基因启动子的活性分析

(1)准备质粒

    将需要研究的基因的启动子构建到报告基因载体上，一般位于报告基因编码序列的5'端;如果需要研究不同长度的启动子的活性，就将不同长度的启动子构建到报告基因载体上。

(2)接种细胞

    接种细胞至24孔板，如果是大规模的筛选实验，可用96孔板或384孔板。

(3)转染

    接种细胞24h后，待细胞密度达到70%-80%时，将含有不同长度的启动子的报告基因载体和内参报告基因共转染细胞，--:般需要设置不含启动子的报告基因空载体作为阴性对照，同时以含全长启动子的报告基因载体为阳性对照。

(4)细胞裂解

    24h后收集细胞，也可根据实验需要调整收集细胞的时间。弃去细胞培养基，PBS洗一遍，每孔加入100pL报告基因裂解缓冲液，室温摇床孵育15min，-70°C放置 2h至过夜。

(5)活性测定

    拿出24孔板，室温融化，吸出孔内的液体(含细胞),振荡10min，4C离心15min,转速为12000r/min，吸取上清至一新的EP管内。吸取10pL上清液至20μL荧光素酶底物中，微孔发光检测仪测量荧光素酶活性。吸取30pL上清加入50μL含ONPG和β-巯基乙醇的缓冲液中，37°C放置，直到变成黄色，OD420nm 读取吸光值(见图1-2)。

2.转录因子的活性分析

(1)准备质粒

    将含有转录因子结合位点的启动子构建到报告基因载体上。

(2)接种细胞

    接种细胞至24孔板，如果是大规模的筛选实验，可用96孔板或384孔板。

(3)转染

    接种细胞24h后，待细胞密度达到70%~80%时，转染如下质粒:含有启动子的报告基因载体+过量表达或敲低转录因子的载体+内参报告基因。

(4)细胞裂解和活性测定

    方法同钱。

3.转录共调节因子的活性分析

    转录共调节因子一般通过与转录因子直接或间接相互作用发挥转录调节的功能。

(1)准备质粒

    将含有转录共调节因子调节位点的启动子构建到报告基因载体上。构建转录共调节因子和相应的转录因子的过量表达或敲低载体。

(2)接种细胞

    接种细胞至24孔板，如果是大规模的筛选实验，可用96孔板或384孔板。

(3)转染

    根据不同的实验目的，可设计不同的转染方案。

    ①研究转录共调节因子的功能，细胞表达内源的转录因子，需要转染:转录共调节因子的过量表达或敲低载体+含有启动子的报告基因载体+内参报告基因。

    ②研究转录共调节因子的功能，细胞不表达相应的转录因子，还需要转染转录因子表达载体。需要设置转录共调节因子和转录因子的空白对照。

    ③转录共调节因子发挥功能是否通过该转录因子。需要转染:转录共调节因子的过量表达或敲低载体十转录因子的敲低载体+含有启动子的报告基因载体+内参报告基因。需要设置转录共调节因子和转录因子的空白对照。

(4)细胞裂解和活性测定方法同前。

实验结果分析

1.基因启动子的活性分析

    以分析雌激素受体a (Estrogen reeptor alpha, ERα) 基因的启动子为例，首先将全长(2803bp)和不同截短突变体的ERα启动子(293bp、 693bp、 1057bp、 1537bp、 2019bp)构建到报告基因载体pGL3- basic上[见图1-2(a)]。将上述载体和空载体(0bp) 分别转染乳腺癌细胞MCF7，同时共转内参报告基因载体，24h 后收细胞，检测活性，从图中[见图1-2(b)]可以得出以下结论:①293bp的ERα启动子已经具有较强的活性，可能是由于此段区域具有基本转录复合体结合的区域;②293bp至693bp是一段转录增强区域，可能有转录增强因子结合这段区域发挥功能;③1057bp转录活性较高，而1573bp转录活性较低，因此，推测1057bp至1537bp 是一段转录抑制区域，可能有转录抑制因子结合这段区域并发挥转录抑制作用;④2019bp 和2803bp转录活性均与1537bp水平相当，推测1537~ 2803bp之间无转录调节区域。

图1-2 ERa启动子截短突变体的构建及活性分析
(a) ERa 启动子截短突变体示意图，其中“+1”代表转录的起始位置，“一2803"、“-2019”、“-1537"、“一1057”、“一693”和“一293”代表转录起始位置的5'端的2803bp、2019bp、 1537bp, 10576p、693bp 和293bp的位置，上述启动子片段均分别构建在报告基因Duciferase(Luc)的5’端。(b)分别将上述启动子转染MCF7,细胞，检测荧光素酶活性

2.转录因子的活性分析

    以转录因子ERα为例，ERα蛋白通过结合雌激素(E2)， 募集到下游基因的启动子上，调节这些基因的表达，pS2基因为ERα的下游基因，构建pS2启动子调控的报告基因载体pGL3-pS2，此外，还需要构建ERα的表达载体。

    将ERα表达载体和空载体分别转染293T，同时共转染pGL3-pS2和内参报告基因载体，即:①ERα表达载体的空载体+ pGL3-pS2+内参报告基因载体;②ERα表达载体+ pGL3-pS2+内参报告基因载体，各两个孔。转染后加人雌激素(E2)， 24h后收细胞，检测活性。由于293T细胞无内源的雖激素受体，因此，在不转染ERα的情况下，加入E2不改变pS2启动子的活性（见图1-3左边的柱图）。转染ERα后，转录活性明显升高，特别是加入E2后，转录活性升高到空载体的6-7倍，提示ERα结合E2后，募集到pS2的启动子上，升高pS2启动子的活性（见图1-3右边的柱图）

图1-3 ERa调节pS2启动子的活性
293T细胞共转染ERa表达载体、pGL3-pS2 和内参报告基因载体，加人E2(10nmol/L), 24h后收细胞，检测活性。左边的柱子对应的细胞中没有转染转录因子ERa,右边的柱子对应的细胞中转染了ERa

3.转录共调节因子的活性分析

    转录因子发挥功能受到转录共调节因子的调控。以FHL2和ERa为例，要证明FHL2是ERa的转录共调节因子，包括三部分工作:首先需要在细胞内明确FHL2对ERa转录活性的调节，可以通过检测含雌激素应答元件(ERE) 调控的报告基因的活性;其次是证明FHL2抑制ERE报告基因的活性依赖于ERa;最后还需要证明FHL2与ERa存在直接或间接的相互作用，并募集到ERa下游基因的启动子上。

    可以利用两种细胞系明确FHL2对ERa转录活性的调节，一种是ERa阳性的细胞，如T47D，由于有内源的ERa,只需转染FHL2的表达载体或空载体、含雌激素应答元件(ERE)调控的报告基因和内参报告基因，加入E2刺激24h,收集细胞，检测活性。如图1-4(a)左边柱图所示，加入E2后，ERE-Luc的活性明显升高，更重要的是，转染FHL2的活性明显低于对照组[见图1-4(a)右边柱图]，说明FHL2能够抑制ERE-Luc的活性。另一种细胞是ERa阴性的细胞，例如MDA-MB-231细胞，在不转染ERa表达载体的情况下，ERE的活性很低，E2不能刺激其活性，而且FHL2不调节转录活性，转染ERa后，ERE的活性明显升高，加激素后活性进一步升高，更重要的是，FHL2能够抑制ERE的活性，此外，本实验也证实FHL2抑制ERE的活性依赖于ERa [见图1-4(b)]。

图1-4FHL2抑制ERE的转录活性
(a) T47D细胞转染FHL2的表达载体、含雕激素应答元件(ERE)调控的报告基因和内参报告基因，无酚红培养基饥饿处理24h后，加入E2刺激24h,收集细胞,，检测ERE活性。(b)MDA-MB-231细胞转染ERa和FHL2的表达载体、含雌激素应答元件(ERE) '调控的报告基因和内参报告基因，加人E2刺激24h,收集细胞，检测ERE活性

    为了进一步明确FHL2抑制ERE的活性是否依赖于ERa,可以通过敲低T47D细胞内源的ERa进行研究，如图1-5 所示，在不转染ERasiRNA、过量表达FHL2的情况下，ERa转录活性低于对照组，转染ERasiRNA后，细胞内ERa表达水平降低，ERE的活性明显降低，E2刺激的倍数也显著降低，更重要的是，FHL2抑制ERE活性的功能也大大降低了，上述结果充分说明FHL2抑制ERE的转录活性，并且抑制作用依赖于ERa。

图1-5 FHL2 调节ERE的转录活性依赖于ERa
T47D细胞转染FHL2的表达载体、ERasiRNA表达载体、含雌激素应答元件(ERE)调控的报告基因和内参报告基因，加入E2刺激24h,收集细胞，检测ERE的活性

疑难解析

1.分析转录活性时，以β-gal为内参报告基因，检测β-gal时发现，随着时间延长，β-gal数值降低

    β-gal以ONPG为作用底物，发生生色反应，使溶液变为黄色，随着ONPG的耗尽，黄色又会渐渐褪去，因此，以β-gal 为内参报告基因，需要及时用Na2CO3终止反应，并检测OD值。

2.转录活性结果不稳定

    由于转录活性的高度灵敏性，实验中很小的细节都可能影响结果的稳定性。例如细胞的转染效率、质粒的浓度和纯度、操作不当等。因此，给出以下建议：

    ①实验设置复孔，结果中标出平均值和标准差;

    ②选择状态好的细胞进行转染实验;

    ③用于转染的质粒最好同时提取，以避免批次间的差异;

    ④实验过程中，在手法上对每个样品的操作尽量保持--致，避免由于操作导致结果不稳定。

3.分析转录因子转录活性时，细胞内转染报告基因空载体和转录因子，发现转录因子对报告基因空载体就有活性?

    可能是由于报告基因空载体本身序列含有转录因子的作用位点，转录因子可以作用于远离启动子的增强子或抑制子而发挥功能，例如Promega公司的报告基因载体PGL3载体序列就包含了很多转录因子的结合位点，因此，Promega 公司新开发了pGL4系列载体，对载体本身的序列进行了改造，尽可能地去除了内在的转录因子作用位点。此外，如果载体本身的转录因子作用位点不可避免，可以在转录活性检测时增加报告基因空载体的对照。

4.分析转录因子转录活性时，转录因子存在猝灭现象

    转录因子发挥功能是非常高效的，很少量的转录因子就能发挥非常高的转录调节作用，如果转染的转录因子量太高，细胞内合成过多的转录因子，可能导致转录因子过多占用基因转录中的“资源”，影响基因的转录和结果的可靠性。因此，最好先检测细胞内源的转录因子表达水平，在此基础上通过转染适当提高转录因子的水平，也可以通过剂量效应分析合适的转染剂量。此外，可以通过siRNA敲低内源转录因子对结果进行验证。

5.检测荧光素酶活性时，数值衰变太快

    普通的荧光素酶半衰期较短，可以换成Promega公司的Steady-Glo系列产品。

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