天下万物，皆有其度，小至细胞尺寸，大到生命长度。本文我们简单聊聊可度量生命长度、聊衰老如何也绕不过去的“细胞生命时钟”——端粒。

一、端粒简介

“年年岁岁花相似，岁岁年年人不同”。体内的细胞每时每刻都在进行着染色体复制和细胞的分裂，但这种“轮回”也并非永恒，分裂一定次数后，分裂过程就会停滞。那究竟是什么控制了细胞的更新换代呢？

答案当然是端粒，端粒是真核生物染色体线性DNA分子的末端结构，为DNA-蛋白质复合体，膨大呈粒状，像两顶帽子那样盖在染色体两端，其作用是维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性。

2009年的诺奖宣告：“端粒”这一结构在默默地把控细胞宿命。“蜡炬成灰泪始干”，当端粒没有办法再提供染色体时，细胞就会因为无法分裂而死亡，端粒也因此被科学家们称为“生命时钟”，端粒的缩短也被认为是细胞衰老的生物学标记。由此，端粒与衰老、疾病的关系成为了科研界的香饽饽，端粒长度的检测也成了热门。

二、端粒长度的检测

测量方式	方法	精确度	技术难度	成本
southern blot	技术优化版的TRF	非常高	非常高	非常高
flow-FISH	定量荧光原位杂交法	一般	一般	偏高
定量-PCR	实时定量PCR法	低	容易	一般

1. Quantitative Polymerase Chain Reaction（Q-PCR）

Q-PCR 是一种相对简单的检测。通过测量端粒信号 ( T ) 与参考单拷贝基因信号 ( S )的比率T / S，用于确定相对 TL（Telomere Length，端粒长度）。但也因为 Q-PCR 仅提供相对定量，因此数据通常不会以kb形式的绝对端粒长度呈现，除非与具有由另一种方法确定的平均 TL 的参考细胞系进行比较。而且，由于使用了不同的单拷贝基因，不同实验室之间的结果可能存在很大差异。此外，Q-PCR 不提供有关最短端粒的信息。最后，用于 TL 测量的 Q-PCR 可能不适用于癌症研究，其中的内参单拷贝基因可能由于非整倍性而被复制或丢失。因此，Q-PCR 的适用性仅限于正常二倍体和核型稳定的样品。

2. Terminal Restriction Fragment analysis（Southern Blot）

TRF （Southern Blot）分析是使用 (TTAGGG)n 标记的探针开发的，现在是一种广泛使用的端粒测量方法，Southern Blot方法也被认为是端粒长度检测的金标准，根据端粒序列特异且重复的特性，用一组缺乏端粒识别位点的频繁切割限制性内切酶（如HinfI和RsaI）消化基因组DNA，基因组DNA被消化成短片段，端粒DNA不被切割以较长的片段保留。不同长度的DNA 消化产物在琼脂糖凝胶上分离，用端粒DNA特异的探针通过Southern blot方法检测端粒长度。不同长度的端粒产生弥散的信号，通过软件与已知分子量 DNA梯度条带比较来评估平均端粒长度，通过标准化参照样本来修正实验之间的“胶效应”。

3. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization（Q-FISH）

间期 Q-FISH (图5a , b ) 使用显微镜确定与荧光肽核酸 (PNA) 端粒重复序列 (CCCTAA)3 探针杂交后的端粒荧光强度。中期 Q-FISH （图5c）可以更准确地测量每个染色体末端的 TL，但需要增殖期细胞。间期 Q-FISH 的商业改造，称为高通量 Q-FISH (HT Q-FISH)，可以在 384 孔板上使用自动化程序对固定淋巴细胞进行大规模研究。Flow FISH（类似于Q-FISH）也是一种市售的方法，通过荧光激活细胞分选分析（FACS）技术确定单个间期细胞中的端粒荧光。Flow FISH 具有更高的通量，从而允许进行一些更大规模的研究，主要是对人类淋巴细胞端粒长度的检测。然而，由于探针杂交的限制，Q-FISH 方法无法检测染色体末端端粒重复片段低于 PNA 探针杂交的阈值（所谓的无端粒末端）时的荧光信号，所有 Q-FISH 技术的另一个缺点是探针还可能与一些间隙端粒序列 (ITS) 结合，这些序列由非染色体末端的端粒重复序列组成，从而产生一些假阳性结果。

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