本文介绍了端粒长度检测的方法，包括端粒长度的测定的所需仪器及试剂，和实验步骤。

一、试剂耗材

试剂耗材
琼脂糖	5×loading buffer	DIG-labeled molecular marker
DIG Easy Hyb	Telomere probe	Hinf I 与 Rsa I
Antibody Solution	脱嘌呤液	变性液
中和液	20×SSC	2×SSC
低严谨性洗脱液（洗膜液I）	高严谨性洗脱液（洗膜液II）	马来酸缓冲液
Washing Buffer	Blocking Solution	Detection Buffer
带正电荷的尼龙膜	双圈定性滤纸	普通滤纸
平板纸	塑料托盘	玻璃棒

二、仪器

仪器
电泳槽	全温培养摇床	切纸机
移液器	自封袋	封口机
水浴锅	台式微量高速离心机	移液器
100孔离心管盒	X射线摄影暗匣

三、实验材料

以人类基因组DNA和对照DNA为例

限制酶：Hinf I和 Rsa I

四、实验方法

1.基因组酶切

①样品准备：取人类基因组DNA17μL，加入2μL酶切缓冲液（10X）、0.5μL Hinf I和0.5μL Rsa I，总体系20μL
取对照DNA15μL，加入2μL无核酶水，然后加入2μL酶切缓冲液（10X）、0.5μL Hinf I和0.5μL Rsa I,总体系20μL DIG 标记marker：marker 4μL+4μL 5×loading buffer +12μL无核酶水。

②.37℃水浴2h，分别加入5μL 5×loading buffer 终止反应。

③.电泳准备：配制1×TAE缓冲液；配制0.8%的琼脂糖凝胶。

④.电泳:将样品点入相应泳道，70V电泳3h。

2.变性

①.将100孔离心管盒的底座（下简称为盒）、玻璃棒、塑料托盘清洗干净，纯水冲洗，倒置晾干。

②.终止电泳，小心将凝胶取出，置于盒中，加入约150 ml的脱嘌呤液，放入37 °C摇床中，40 rpm, 10 min。

③.倒掉脱嘌呤液，100ml ddH₂O冲洗2遍。

④.加入约150mL变性液，放入37℃摇床中，40rpm，15min。

⑤.倒掉变性液，重复步骤。

⑥.倒掉变性液，100ml ddH₂O冲洗2遍。

⑦.加入约150mL中和液，放入37℃摇床中，40rpm，15min。

⑧.倒掉中和液，重复步骤。

⑨.倒掉中和液，加入约150mL 20×SSC，浸泡10min。

3.转膜

①.用切纸机将尼龙膜及双圈定性滤纸切成100×100mm；将普通滤纸切成130×260mm，将平板纸大致切割成150mm×115mm。

②.盒子倒扣于塑料托盘中，将130×260mm滤纸置于盒上，倒入少量20×SSC浸湿滤纸，小心用玻璃棒

③.小心将浸泡过的凝胶置于滤纸上，用玻璃棒赶走多余气泡。

④.将尼龙膜直接置于凝胶上，用玻璃棒赶走多余气泡。

⑤.用废旧的胶片封好四周，注意不要压住核酸区域。

⑥.将一摞（约18cm）平板纸置于滤纸上，小心盖上一本说明书。

⑦.在托盘中加入约500ml 20×SSC，过夜静置、转膜。

⑧.次日早晨，丢弃底部潮湿的平板纸，更换为新的平板纸，继续转膜2-3h。

4.固定

①.取走上层的重物、平板纸、废旧胶片及滤纸，小心用铅笔在尼龙膜上的右下角做好标记，用镊子夹住尼龙膜的一角，核酸面向上将其放入盛有约100ml 2×SSC的溶液中，浸泡10min，去除多余盐分。

②.用酒精棉球擦拭凝胶成像仪的玻璃板，并自然风干。

③.将尼龙膜的核酸面向下，置于凝胶成像仪中，打开紫外灯，紫外照射固定15min，固定结束。

5.预杂交

①.取10ml DIG Easy Hyb，37℃预热。

②.固定好的尼龙膜，核酸面向上置于自封袋中，将预热好的DIG Easy Hyb倒入自封袋中，赶走气泡封口，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应3h。

6.杂交

①.吸取适量的探针（使探针终浓度约25ng/ml）置于50μL PCR管中，100℃沸水反应5min。

②.迅速置于冰上冷却3min，瞬离。将探针加入预热的10ml的预杂交液中。

③.打开自封袋取出膜，放到新的自封袋中，迅速加入杂交液，赶走气泡封口，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应过夜。

7.化学发光

①.在100孔离心管盒的底座（下简称为盒）中倒入200ml 37℃预热的低严谨性洗脱液，取出尼龙膜，核酸面向上，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

②.尽弃低严谨性洗脱液，再加入200ml 37℃预热的低严谨性洗脱液，核酸面向上，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

③.尽弃洗脱液，加入200ml 65℃预热的高严谨性洗脱液，核酸面向上，置于65℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

④.将尼龙膜放入有100ml Washing Buffer的盒中，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm 反应5min。

⑤.倒掉Washing Buffer，加入100ml Blocking Buffer，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应1h。

⑥.倒掉Blocking Buffer，加入20ml Antibody Solution，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应30min。

⑦.倒掉Antibody Solution，加入100ml Washing Buffer，置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应15min。

⑧.倒掉Washing Buffer，加入100ml Detection Buffer,置于37℃摇床中，核酸面向上，40rpm反应5min。

⑨.尼龙膜核酸面向上置于保鲜膜上，均匀滴加1ml CSPD，迅速覆盖上保鲜膜，室温反应5min（注意不要让膜干掉）

⑩压片1h，显影、定影、记录结果，根据信号强度，调整压片时间，直到获得满意的曝光结果。

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