端粒酶活性的测定方法

    本文介绍了端粒酶活性的测定方法，包括端粒酶活性的测定的所需仪器及试剂，和实验步骤。

端粒酶活性测定所需材料

材料
细胞	PBS
冰冷的洗脱缓冲液V	冰冷的细胞裂解液
DEPC处理过的水	10X端粒酶反应缓冲液
20mmol/L dATP、dGTP和dTTP混合液	引物，用于端粒酶合成
5U/μl Taq聚合酶和10X反应缓冲液	1mmol/L dNTP
抗Taq的抗体(TaqStart, Clontech) 或热启动Taq聚合酶	寡核苷酸引物(ATCGCTTCTCGGCCTTTT)
TSNT (DNA模板: AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT)	6 X DNA上样缓冲液
12%非变性聚丙烯酰胺胶	10 X TBE或TAE缓冲液

仪器

仪器
匀浆器	PCR仪
聚丙烯酰胺胶电泳槽	干胶器磷光成像系统(Typhoon 或Storm)或同等仪器
分析软件(Image Quant或其他类似软件)

    1.于1.5ml离心管中用1ml PBS悬浮1X10⁶个细胞。4℃, 8000g离心5min。 用20-100pl冰冷的洗脱缓冲液V悬浮细胞，继续离心。

    2.用20-100μl冰冷的细胞裂解液悬浮1X10⁶个细胞或1μg蛋白质。冰浴30min,12 000g离心30min。对于组织，可切成合适大小后，置于细胞裂解液中用匀浆器匀浆。

    3.将上清小心转人干净和预冷的1. 5ml离心管中。取10μl用来测定端粒酶活性，其余的上清可置于一80℃保存6个月到一年。

    4.在0.5ml离心管(或0.2ml PCR管)中，加入5μl细胞裂解物，2.5μl DEPC处理过的水，2.5μl端粒酶反应缓冲液(1μl 10X端粒酶反应缓冲液，各1μl 20mmol/LdATP、dGTP和dTTP, 0.5μl 引物)，于22C孵育60min或30℃孵育30min。取2μl端粒酶合成产物用于PCR扩增，其余的可于一20℃保存2周。

    5.为了定量端粒酶活性，需设置以下对照:①热变性的样品，将细胞裂解液置于85℃孵育10min以灭活端粒酶;②阳性对照:具有端粒酶活性的细胞裂解物(如肿瘤细胞293);③阴性对照:仅细胞裂解液。

    6.末端标记的端粒酶扩增引物。

    7.在2μl端粒酶合成产物及对照中，加入共18μl的下列试剂:

2μl 10XDNA Taq聚合酶反应缓冲液	2μl 1mmol/L dNTP
0.5μl [r-32P] 标记的端粒酶扩增引物	0. 2μl 20μmol/L ACX引物
0. 2μl DNA Taq聚合酶	0.2μl抗Taq的抗体或热启动Taq聚合酶
0.2μl 20μmol/L寡核苷酸	1μl 1~10amol/μl TSNT
11. 7μl DEPC处理过的水

    在PCR反应过程中，Ts和NT作为扩增TSNT DNA的引物而TSNT作为模板。此处的TSNT DNA作为PCR扩增反应和后续定量的内部参照。由于TSNT能够和Ts引物竞争从而影响端粒扩增产物，所以必须通过检测由不同端粒末端转移酶活性得到的端粒扩增产物来调整加入的TSNT的量。使用已知数量的DNA(0.1amol)和一种特殊模板(R8)可以定量检测产生的端粒扩增产物，以此来反应端粒末端转移酶活性(步骤11,可选)。

    8.混匀，用下列程序作PCR:

    起始循环 　　　　94℃ 30s

    28~32个循环 　　　　94℃ 20s

     　　　　 　　　　60℃ 30s

    扩增好的DNA立即电泳。

    9.加入4μl 6XDNA上样缓冲液于每个样品中，混匀，取8μl加入12%非变性聚丙烯酰胺胶的上样孔中，200V 电泳约1.5h。当第二种染料xylene cyanol电泳至胶底部时，终止电泳。真空中65℃, 30min干胶。胶片曝光或感光屏感光。

    10.获取图像。通过磷光成像仪(用100μm或者更高分辨率)得到凝胶图像，或者通过光密:度计得到成像的胶片。一个成功的TRAP测试中，所有样本都有一条36bp的条带相当于内部参照。此外，阳性对照和定量对照中还有一条从50bp开始的以6bp为递增幅度的DNA产物梯状条带，而阴性对照和热处理样本没有≥50bp的DNA产物梯状条带。

    11.测量对照条带及端粒酶产物条带的灰度，用相对于阴性对照的相对比值或总的端粒酶产生值(telomerase product generacted, TPG)来表示结果。公式如下:

    式中，Ix代表样品x所有条带的总信号强度; I₀代表热灭活样品的总信号强度;ICx代表样品x的内参信号强度; C_R代表R8的信号强度; C₀代表阴性对照的信号强度; IC_R代表R8内参的信号强度。

    为了比较不同样本，端粒产物和内参待测信号强度的面积大小应该在所有样本中是相同的。Ts引物在扩增内参DNA和合成的端粒重复序列的扩增中的竞争性可以通过扩增的内参条带的抑制来定量端料产物，通过与已知定量的R8DNA产物相比较，可以定性和定量地分析细胞或组织样本中端粒酶的活性。实验常见问题见下表。

TRAP分析的常见问题的可能原因及解决方法
问题	原因和解决方法
端粒酶活性产物（TRAP）在包括无样品的泳道中都存在	PCR试剂的问题——更换新的试剂
TRAP和内参带在阳性对照中有但样品中没有或很少	裂解物中含有TaqDNA聚合酶的抑制剂——用裂解缓冲液稀释检测样品以稀释抑制剂
鼠端粒酶样品的活性很弱	本方法测定鼠端粒酶的活性不如人的样品敏感——可使用Intergen公司的TRAPeze试剂盒
内参和样品端粒酶产物之间的竞争是非线性的	优化TSNT的使用浓度

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