运用TaqMan探针法进行荧光定量pcr实验时，会有很多技术关键点容易被疏忽，本文列举了9个TaqMan探针法中的注意事项。

一.引物设计

1.序列选取应在基因的保守区段。
2.Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp。
3.避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对。
4.避免引物自身形成环状发卡结构。
5.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%。
6.引物之间的Tm值相差避免超过2°C。
7.引物的3’端避免使用碱基A。
8.引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
9.为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。
10.探针位置尽可能地靠近上游引物。
11.探针长度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%。
探针的5'端应避免使用碱基G。
12.整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
13.为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在Blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

二.引物退火温度

引物的一个重要参数是熔解温度(Tm).这是当50%的引物和互朴序列麦现为双维NA分子时的温度，Tm对于设定PCR遇火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火同时还要足够高以减少非特异性结合。合理的退火温度从55°C到70°C.退火温度般设定比引物的Tm低5°C。

三.引物浓度

引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度般在0.1到0.5uM. 较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

四.引物、探针的纯度和稳定性

1.定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100%。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'→5'合成。在任何一一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
2.引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE中重溶引物,使其最终浓度为100μM。也可以用双蒸水溶解。
3.引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在20°C.以大于10uM浓度溶于TE的引物在20°C可以稳定保存6个月，但在室温(15°C~ 30°C )仅能保存不到1周。干粉引物可以在20°C保存至少1年，在室温(15°C~30°C)最多可以保存2个月。
4.由于反复冻融易导致探针降解.在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2uM(10x)，作为工作浓度分装多支，避光保存。

五.热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

六.镁离子浓度

镁离子影响PCR的多个方面，如:对DNA聚合酶的活性的影响进而影响产量;对引物退火的影响，进而影响特异性。若dNTP和模板同镁离子结合，则降低了酶活性所需要的游离镇离子的量。

七.模板质量

模板的质量会影响产量。DNA样品中可能有多种污染物会抑制PCR.

八.模板浓度

始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光定量PCR扩增, 10⁴~10⁶个起始目的分子就足以观测到好的荧光定量曲线(或在溴化乙锭染色胶上观察到)。所需的最佳模板量取决于基因组的大小，质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。对于一般的检测样品，10~100ng的量就足够检测了。当然对模板做-个梯度稀释，对于定量PCR而言是非常容易，且能分析扩增效率。

九.防止残余污染

1.PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其它样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源(非残余污染)。

2.可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用带滤芯的移液管可以阻止气雾剂进入Eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成份，而不是每个反应的每个试剂单独加入。

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