16srDNA提取与检测方法

一、样品总DNA的提取

1、实验操作：

1.1 细胞分裂

称取0.5g样品入含0.3g锆珠、已灭菌的screw-capped tube 中，加入1mL TN150，和150µL 酸性酚，bead-beater匀浆(5000rpm,3min),冰上冷却，加入150µL氯仿/异戊醇，涡旋混匀，10000rpm离心，5min。转移上清液至已灭菌的eppendorf管。

1.2 DNA提取

加入150µL氯仿/异戊醇，和150µLTE饱和酚至上述eppendorf管中。涡旋混匀1min，10000rpm离心1min，上清移入灭菌的eppendorf管中，重复上述步骤直至水相之间的界面清晰为止，上清移入灭菌的eppendorf管中，加入300µL氯仿/异戊醇，10000rpm离心1min，上清移入灭菌的eppendorf管中，加入96%冷乙醇1mL，和50µL3M NaAc (pH=5.2),-20℃沉淀DNA过夜。10000rpm离心20min，弃上清，加入500µL70%冷乙醇溶解沉淀，10000rpm离心5min弃上清。风干沉淀，加入50µLTE缓冲液溶解DNA，-20℃保存提取的DNA。

2、实验注意事项：

酚是致癌物质，实验操作应配带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。实验中使用了挥发性有毒物质，操作应在通风橱中进行。
实验过程中样品应放置冰面上，所有离心操作在4℃下进行。

二、DNA的检测—琼脂糖凝胶电泳

1、实验操作：

1.1、1.2%琼脂糖凝胶的制备：

• 用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床的两端开口封好，形成一个胶模，水平放在工作台的位置上，插入样品梳，与底面相距0.5-1mm。
• 称1.2g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入100mL 1*TAE稀释缓冲液，加热直至琼脂糖完全溶解(透明溶化液)。待冷却至60℃戴手套操作：小心加入5µLEB染色贮存液，摇匀。
• 将琼脂糖倒入胶模中，倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。
• 待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出样品梳。
• 取下封边的胶带纸，移入电泳槽，倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面2-3mm。

1.2点样：用微量加样器或可调枪依次将所提取DNA与加样缓冲液(loading buffer)5:1混合后点入加样孔内。

1.3电泳：100mv.电泳15-20分钟。

1.4观察：紫外检测。

2、实验注意事项：

溴化乙锭(EB)是诱变剂，配置和使用时应带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上，凡是被其沾污的地方必须专门处理后才可进行清洗和消毒。
加样多少取决于加样槽大小，加入样品体积应略小于加样槽体积。
观测时避免紫外灯对眼睛的伤害。

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