16S rDNA 鉴定细菌的方法

细菌 16S rDNA 鉴定主要分为 7 个部分：

1.提取细菌基因组 DNA,
2.设计/选择引物进行 PCR 扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离
4.胶回收目的片段
5.目的片段测序。
6.BLAST 比对获取相似片段。
7.构建系统进化树

试剂：

1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响 DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用 TE 缓冲液对菌体进行洗涤。）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调 pH，每升高 1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用 NaOH 调 pH 至 8.0（约 20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取 100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取 20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer 用 10×TE Buffer 稀释 10 倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称 10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调 pH 至 7.2。室温保存。用之前在 65℃溶解。配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称 292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解 4.1g NaCl，加 10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在 65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1 的比例混合 Tris-HCl 平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE 缓冲液：使用液 1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液 50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。
12、0.6%琼脂糖凝胶：称取 0.3g 琼脂糖用 TAE 溶液配置 50 ml。
13、EB：10 mg/ml。称取 1g 溴化乙锭定容至 100ml。棕色瓶室温避光保存。EB 的工作浓度为 0.5ug/ml。当配置 50ml 琼脂糖凝胶时加入 EB 为 2.5ul。（因 EB 是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有 Gelred 等）
14、蛋白酶 K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度 50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度 37-56℃。无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加 1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水 2460 ul，于 100℃加热 15 分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避免 RNA 的干扰，使用 RNA 酶降解基因组中的 RNA。）

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