哺乳动物稳定细胞株筛选常见问题

1、单克隆细胞株与多克隆细胞系的区别及如何挑选单克隆细胞株？

多克隆细胞系也就是一般认为的细胞株，是多个阳性细胞克隆的混合细胞群，每个细胞其外源片段的整合位点不一样，在长期培养过程中容易出现表型不稳定现象。而单克隆细胞株是由单个细胞分裂扩增形成的单一细胞群，可以长期稳定维持表型，大部分情况下，多克隆细胞系足以保证实验完成。而对于细胞亚定位实验，基因表达效率低，细胞难转染的情况，以及药物靶点筛选等要求较高的实验，则更建议进行单克隆细胞筛选。单克隆挑取常用方法包括平板挑取法、有限稀释法等，对于存活率较低的细胞，推荐平板挑取法，对于克隆形成效率高的细胞，有限稀释法即可，操作更方便。
平板挑取法常见的是克隆环法，具体操作为将50-100个细胞均匀接种在10厘米培养皿中，2-3周形成肉眼可见细胞团后，去除皿中的液体，使用克隆环扣住一个克隆，经胰蛋白酶消化后，将细胞转移至新的板中继续扩大培养后验证即可。
有限稀释法，起初细胞只接种在一个孔中，通过先纵向，后横向两步梯度稀释。使最终在细胞培养板的一个孔中仅有1个细胞做好标记，4-5天后，将长好的单克隆细胞适时转移至24孔或12孔板中扩大培养并验证即可。

2、为什么无法得到理想的细胞株、稳定株可以传多少代？

稳定株筛选失败，首先考虑细胞本身，一些细胞系自我修复能力强，可能导致基因插入后丢失。在实验操作过程中，病毒感染MOI值，筛选时药物的浓度，和筛选的时间都至关重要。细胞感染也可导致筛选过程不顺利，建议查找污染源，排除污染后重新实验。

得到的稳定株可以传多少代？传代次数与外源基因的表达稳定性，以及细胞基因组的遗传稳定性相关，一方面细胞内部存在DNA损伤修复机制，这就使得外源插入基因区域，会发生重组修复，导致外源基因的丢失，从而影响稳定表达。另一方面，随着细胞的传代次数增加，传代培养引起的遗传变化可能会改变，细胞的生理学特征和基因调控方式不利于研究进行，所以我们建议尽快完成实验，使用代数应控制在10代以内，并且尽量避免反复冻存和复苏细胞。

3、如何筛选稳定细胞株？

根据筛选流程，确定药物最佳浓度，慢病毒感染细胞，加入药物进行筛选，空白细胞大量死亡，更换新鲜培养基，进行细胞传代培养和冻存，筛选出稳转株后，定期使用药物维持表达效率。在进行筛选前，可以使用药物杀伤曲线，来确定最低有效药物浓度。

以嘌呤霉素为例，提前12小时，将未处理细胞接种到24孔板，确保第二天细胞融合率在50%-60%，第二天用不同浓度梯度药物的完全培养基处理细胞，48-72小时后，选取90%以上细胞被杀死的最低浓度进行后续实验。在慢病毒感染后，加入药物的时间非常关键。慢病毒感染细胞后，需要经过逆转录，整和基因组，转录和翻译过程，才能表达蛋白质，因而不能过早。
而转染外源基因的，细胞代谢负荷较大，病毒感染时间过长，会导致与空白细胞竞争处于劣势，因此也不能过晚。一般在慢病毒感染后，48-72h加入药物较为合适，加入药物进行筛选后，细胞会大量死亡，此时细胞碎片和胞内物质，也会影响存活细胞活力。所以待空白组细胞全部死亡后，要根据细胞状态，更换新鲜培养基，进行细胞传代培养和冻存。在筛选出稳转株后，传代培养时，需要定期使用含药物的培养基来培养细胞，来维持表达效率，后期的药物培养浓度，我们建议使用筛选浓度的1/10-1/2。

4、为什么要构建稳定细胞株？
答：对于少量、临时的实验，瞬时转染是完全符合需求的，但是如果试验中需要长期大量的使用某种细胞，我们就需要构建稳定细胞株，构建稳定细胞株的好处在于
1、可以减少不同批次实验中转染效率差异带来的实验结果差异，提高实验的可重复性。
2、构建好细胞系后不必再进行瞬时转染实验以及反复制备质粒，减少工作量。3、不再使用价格高昂的转染试剂，节约实验成本。

5、所有的细胞株都可以构建稳定细胞系吗？
答：不是所有的细胞株都能构建成为稳定细胞系的。构建稳定细胞系需要满足2个条件：
1、细胞能稳定传代；
2、细胞的转染效率满足要求。钟鼎生物主要是为科研及工业用户构建过表达细胞株，采用的主要是CHO细胞和293细胞。

6、构建好的稳定细胞系如何培养和保存？
答：我们提供的单克隆和多克隆细胞系培养和保存均与原来的细胞株无异，无需抗生素维持。

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