Southern Blot实验操作方法

  本文详细介绍了Southern Blot印迹杂交的基本方法。印迹杂交能检测通过凝胶电泳分离的混合样本中特定的DNA分子，其原理是通过吸水纸隔着凝胶和膜吸取水时产生的毛细管作用，将DNA分子从凝胶转移到多孔膜上，DNA分子与被标记的核酸探针在膜上杂交而被检测。

Southern Blot实验操作简单，应用广泛，是分子学实验中必备的一项实验技术。

Southern Blot 实验

实验材料

试剂

•电泳缓冲液（TAE或TBE）
•电泳级琼脂糖
•溴化乙锭(0.5μg∙ml-1,水溶解)或其他DNA染色试剂(例如SYBR绿色)
注意：溴化乙锭是致突变性的，因此需要小心处理。使用时需要戴着手套，并根据相关安全规定处理移液器吸头。小心不要接触任何被溴化乙锭污染的手套。
•2×和20×SSC(20×SSC 是3.0 M氯化钠,0.3 M柠檬酸钠)
•6×loading buffer:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯苯胺FF和30%的甘油
•DNA marker
•预杂交及杂交液：6×SSC，0.5% SDS，5×Denhardt溶液和100mg∙ml-1变性液
•Denhardt溶液：0.02%聚乙烯吡咯烷酮，0.02% Ficoll和0.02%牛血清白蛋白(BSA)
•硝酸纤维素或硝化纤维素过滤器
•核糖核酸酶A(2×20 pg∙ml-1 SSC)
•限制酶和缓冲液
•放射性标记RNA
注意：处理放射性时，必须遵守安全预防措施并遵守国家法规。
•2,5-二苯氧唑(PPO)溶解于甲苯（20% wt/vol；仅用于检测用3H，35S，125I或14C标记的RNA）

耗材

•倒胶的胶槽几卡梳
•电泳槽
适用于从窄条胶中转膜的设置（图1）：
•3片玻璃或有机玻璃，规格为5厘米×20厘米，厚度与凝胶相同
•4或5块厚的干燥滤纸或平板纸，规格为10厘米×18厘米
•由有机玻璃制成的杂交容器（仅步骤20B所需），其内部尺寸为0.8mm深，比待杂交的膜高2cm，长1cm左右（可用其他设备代替）

适用于从宽凝胶中转膜的设置（图2）：
•四条窄的有机玻璃，厚度与凝胶相同，围绕成一圈并与凝胶边缘相距3mm
•深20 - 50mm的托盘，比凝胶长20mm，宽20mm
•一块玻璃片，长度可以放在托盘上，宽度正好与托盘边缘空隙约10mm
•几张比凝胶更大的厚滤纸（或者平板纸），能够完全盖在玻璃片上，浸入托盘中
•一块硝化纤维膜，用2×SSC湿润，完全覆盖上凝胶，然后放在4条有机玻璃条上
•一叠平板纸

转膜流程视频演示

试剂配制

  DNA 应该先使用一组不同酶消化的DNA及不同的DNA浓度进行以下实验，以确定最佳DNA浓度和限制酶。通常，即使对于低拷贝数的样本（例如，质粒或噬菌体DNA），PCR获得1μg的DNA就足够了。当要分离更复杂的DNA（例如，基因组DNA）时，需要的DNA至少是5-10μg。
  电泳缓冲液用 TAE（40 mMTris，20 mM乙酸，1 mM EDTA，pH 7.4-8.2，通常制成20×浓度保存）或TBE（89 mMTris，2.5 mM EDTA，89 mM硼酸盐，通常以10×的浓度保存）。当凝胶跑胶时间较短，并且要从凝胶中回收DNA片段时，使用TAE通常是最佳的选择。 TBE适合于跑胶时间超过2h时使用。

实验步骤

限制酶消化DNA，用时：2-24h

1. 把DNA样本放在冰域上，用适量的限制酶进行酶切。将表1所示的成分添加到离心管或多孔板中。用移液枪头轻轻搅拌均匀，避免泡沫。

表1 基因组DNA的典型限制性消化体系
试剂	用量
DNA(1µg∙µl-1)	10 µl(10µg)
10xbuffer (as supplied with the enzyme)	10 µl (1xfinal concentration)
ddH2O	75µl
Enzyme (10U µl-1)	5 µl(50U)a

关键步骤：一定要加入酶，酶在使用前应保存在-20°C。反应时应使用过量（5-10倍）的酶来确保DNA被完全消化。部分消化引起的碎片可能会模糊所得印迹的分析。然而，酶的总加入量不应超过总消化体积的十分之一，因为酶原料中含有的甘油可以抑制较高浓度的消化反应。为了尽量减少潜在的移液误差，当要测试大量样品时，应该先配置混合液再根据反应体系数量平均分配。

2. 消化反应在37°C(最好在水浴中)进行。对于PCR来源的DNA，通常是1 - 2h足够了。对于基因组DNA，通常需要消化过夜。为了避免酶“耗尽”，一半的酶可以在消化开始时添加，在消化过程中添加。对于长时间消化反应，另一半的酶可以在第二天早上添加，然后继续培养一个小时。

3. 在消化后可能需要浓缩DNA到合适的体系，这样才能加到凝胶加样孔中。对于大多数标准凝胶加样孔而言，一般合适的上样体积是20μl。当加入6xloading buffer时，每孔上样量会变成24μl，具体上样步骤请参阅下面的步骤10。

电泳 用时：1-16h

4.确定所需凝胶的百分比和大小。百分比取决于要分离的片段的大小; 表2中给出了指导。所需凝胶的大小取决于待分离的片段的范围，通常，需要较长的凝胶以确保基因组DNA和相似大小的多个片段能充分分离。对于大多数应用，0.8-2％的凝胶就足够了。为了使一些基因组样品的片段充分分离，可能需要使用低百分比的凝胶，对于0.8％以下的凝胶，您可能需要在凝胶底部使用高百分比（例如，2％）的基础凝胶，因为低百分比的凝胶非常脆弱，注意倒入基础凝胶时不需要插入梳子，基础凝胶一旦凝固，将低百分比凝胶倒在上面，并插入梳子，确保梳子底部不接触基础凝胶。

5. 通过在ddH2O中稀释适量的储备溶液来补充1xbuffer。将合适量的琼脂糖加入锥形瓶中的1xbuffer中，混匀，确保不形成团块。例如，配置150ml的1.5％琼脂糖凝胶时，将2.25g琼脂糖溶解在150ml 1xbuffer中。对于一个18cm×20cm的凝胶，150ml足够的体积。在微波炉或加热搅拌器中将琼脂糖熔化。使用微波炉时，凝胶应每隔30s左右轻轻旋转，以确保凝胶均匀融化。在大多数标准微波炉的默认设置下，凝胶应在3min内完全熔化。
注意：琼脂糖需要时常检查，加热时不要让它无人看管，因为它很容易煮沸。为了将这种风险降至最低，请始终尝试使用比所需琼脂糖体积大三到四倍的锥形瓶。加热完毕后小心过热，当烧瓶移动时，可能导致凝胶突然沸腾喷出瓶口而伤到手。

6. 将含有熔融凝胶的烧瓶转移到磁力搅拌器中。让凝胶缓慢冷却至约50-60°C，同时轻轻地搅拌。如果需要在凝胶添加溴化乙锭，则应在此阶段添加，浓度为0.5μg∙ml-1。

7. 在凝胶冷却的同时，准备足够的1xbuffer（如需含有溴化乙锭，浓度为0.5μg∙ml-1）以填充电泳槽。将buffer倒入槽中，使其比凝胶载体高几毫米。

8. 准备制凝模型，选择合适的制胶梳子。确保凝胶浇铸（梳子就位）在水平表面上，并缓慢倒入凝胶。
关键步骤：尽量避免形成气泡，气泡会导致DNA运行地不规则。通常用黄色移液枪头戳破气泡，去除气泡应该在浇注凝胶后立即进行。

9. 凝胶凝固后（此时外观呈乳白色），轻轻取下梳子。将凝胶转移到电泳槽中，加入1xrunning buffer以覆盖凝胶。尽可能多地添加running buffer，不超过电泳槽的最大量就行，如果要长时间运行凝胶，这一点尤其重要，因为它可以最大限度地提高缓冲能力并最大限度地减少由于热量增加导致凝胶熔化的可能性。
关键步骤：取下梳子的时候尽量温和，以免胶破裂。如果凝胶装置允许，可以在将凝胶放入电泳槽中并用缓冲液覆盖后除去梳子，如果使用低百分比的凝胶，可能有助于在移除梳子之前冷冻凝胶，防止凝胶坍塌。

表2 琼脂糖凝胶浓度对应待分离线性DNA片段的大小
Agarose in gel(percent)	Efficient range of separation of linear DNA(kb)
0.3	60-5.0
0.6	20-1.0
0.7	10-0.8
0.9	7-0.5
1.2	6-0.4
1.5	3-0.2
2.0	2-0.1

10.添加loading buffer至DNA样品中（对于6x原液，每5μl样品加入1μlloading buffer）。用移液管尖端轻轻搅拌混合，避免产生气泡，这会导致样品从孔中漂浮出来。

11. 小心地将样品移到孔中。选择至少1个孔（通常是2个）添加marker，marker用缓冲液制备。Marker的大小由待测样本的大小决定。
关键步骤：将移液器吸头放在孔的顶角正下方，不要将移液器吸头向右推到底部，因为这会刺穿孔或导致样品从孔中喷出。缓慢释放样品也可以最大限度地降低样品从井中漂浮出来的风险。

12. 小心地将盖子盖在电泳槽上，然后将盖子连接到电源上，适当设置电压并接通电源。 DNA片段分离的进展可以参考跑在最前面的染料的进展，如果一切正常，应该看到来自电极的小气泡。对于基因组DNA，最好在低电压下缓慢运行DNA（5-20 V应该没问题），可能需要在低温的房间里过夜。质粒DNA可以在高达100V的电压下运行30min或更长时间，这取决于待分离片段的大小。
关键步骤：DNA带负电，因此会向正电极方向运行。确保最靠近孔的引线连接到电源的负极插座（通常为黑色），并且距离孔最远的引线连接到正极插座（通常为红色）。

转膜前准备 用时:2-3h

13. 如果凝胶在不存在溴化乙锭的情况下进行，则将凝胶浸泡在含有溴化乙锭（0.5μg∙ml-1）的电泳缓冲液中0.5-2h。

14. 将凝胶小心地转移到连有相机的透照仪上。 在相机上使用红色滤光片拍摄紫外线下（256nm;高浓度DNA也可在302或356nm处检测）的凝胶。 在凝胶旁放置一把尺子（这有助于将DNA的荧光照片与杂交后的最终放射自显影相匹配）。 如果DNA没有充分分离，凝胶放回电泳槽中继续电泳。PRC的DNA样本应该显示为不同的条带；基因组DNA应该显示为涂片，具有代表重复DNA元件的更亮条带。此时，可以使用火焰灼烧过的刀片从凝胶上切下待印迹的凝胶区域，如果要转移大片段，可将凝胶浸入稀酸（例如，0.2M HCl中10min）中以诱导脱嘌呤。

15. 通过将凝胶完全浸入1.5M NaCl，0.5M NaOH中15-30min，使凝胶变性，此步骤最好在托盘中不停摇晃进行。

16. 用3M NaCl，0.5M Tris-HCl（pH7）替换1.5M NaCl，0.5M NaOH溶液，再放置15-30min，这一步是中和凝胶。

准备转膜装置 用时：15min左右

17. 对于窄条带的转膜（如图1所示），准备用于转膜的组件，以便有一片厚的滤纸（20厘米×18厘米）浸泡在20Xssc中和一片硝酸纤维素滤膜（与凝胶的长度相当，宽约1厘米）浸泡在2xSSC中。对于整块凝胶的转膜，按照图2组装即可。
关键步骤：将滤纸先漂浮在溶液表面，然后将滤纸浸入并转移，否则会出现气泡，导致转膜不均匀。

18. 对于窄胶条，将浸泡在20xSSC中的大滤纸放在玻璃或塑料表面上，注意避免在纸张下方留下气泡。将20xSSC倒在上面，使表面湿润。对于整块凝胶，用20xSSC填充托盘并在其上铺一块玻璃板，将一叠滤纸浸泡在20xSSC中，然后将其放在盘子上，浸入托盘中如图2所示。

19. 将玻璃或有机玻璃板放在湿纸的顶部。

20. 从中和溶液中取出凝胶条，平行放置在离玻璃或有机玻璃板2-3mm处。

21. 将第二块玻璃或有机玻璃板放置在离凝胶另一侧2-3mm处。

22. 将硝酸纤维素膜放在凝胶顶部，使其边缘放在有机玻璃或玻璃板上，使其桥接在两块玻璃上。 在凝胶与膜接触之前，请小心对齐，并通过从一个边缘缓慢向下贴，避免在凝胶和膜之间出现空气。
关键步骤：膜放置后，不要再移动了，因为DNA的转移可能已经发生。

23. 将吸水纸放在膜上面。

限制酶消化DNA 用时：2-24h

24. 转膜设置垂直放置，完成转膜所需的最短时间取决于片段的大小和凝胶浓度。例如，3小时足以让所有HaeIII（来自大肠杆菌DNA片段）完全从3mm厚的2％琼脂糖凝胶转移出去。但从9mm厚的凝胶转移小鼠大的EcoRI片段，即使20h也完成不了。
关键步骤：在转移过程中，可能需要偶尔在底部的滤纸上添加20xSSC。如果纸张太干，凝胶会使硝酸纤维素膜收缩，后面一旦接触液体会破裂。纸张可能被淹没，但必须注意液体不会填充凝胶和侧面玻璃片之间的空间。

25. 在转膜结束后，小心地提起硝酸纤维素膜，使凝胶保持附着在其下侧。

26. 翻转硝酸纤维素膜并通过用铅笔画一系列点来标记凝胶的轮廓。

27. 从硝酸纤维素上剥离凝胶。在相机上用红色滤光片在紫外光（256nm）中观察凝胶，可以看到凝胶中残留的DNA，因为在处理凝胶期间溴化乙锭没有被完全除去并且仍然会发荧光。

28. 用火焰刀片切割硝酸纤维素，使得与凝胶接触的区域保持不变。

29. 将膜浸入2×SSC中10-20min。

30. 将膜在80°C的真空烘箱中烘烤2小时。或者，DNA可以通过暴露于短波长紫外光而与膜交联。
注意：膜可以在室温下长时间储存，最好时在保持干燥的状态下。

洗膜流程视频演示

封闭 用时：1h

31.在容器中的杂交，将膜放置在少量的闭合液中。
（i）向容器中加入用于杂交的溶剂。
（ii）将膜通过顶部的狭窄开口放入。
（iii）排出多余的溶剂并加入探针溶液。
关键步骤：对于1cm×18cm的膜，需要约1ml的溶液。用于转移几种凝胶的宽片硝酸纤维素太宽,所以不能在这种类型的容器中杂交，可以通过将它们包裹在有机玻璃圆柱体周围，然后将玻璃圆柱插入紧密贴合的管中。以这种方式，可以使24cm×8cm的片与约4ml的溶液杂交。 如果在水浴中进行杂交，则不必密封容器的顶部，只要水浴锅被覆盖即可。容器中的液体将会非常缓慢地蒸发，并且可以通过添加少量水来补充。这种杂交方法的另一个优点是可以回收RNA，并再次使用。
（iv）使膜杂交适当的时间。杂交的时间取决于RNA浓度、其序列复杂性、纯度和杂交条件，但通常大于1h。
（v）离开过夜是可以的，这对于大多数探针来说足够长。

32. 在适当的时间后，从溶液中取出膜，并将它们在滤纸之间进行印迹。

33. 在杂交温度下，在大量杂交溶剂中，在搅拌下洗涤膜20-30分钟。

34. 使用辐射监测器检查背景。 如果背景高，则在20°C下用RNase溶液处理30分钟。

35. 用2×SSC冲洗膜。

36.膜自然晾干

杂交流程视频演示

RNA检测 用时：1–48h 取决于杂交产量和PROBE比活性

38. 检测放射性RNA，使用方法A检测32P标记的RNA和方法B检测3H，35S，125I或14C标记RNA。
（A）检测32P标记的RNA
（i）将膜包裹在Clingfilm或其他塑料包装中。
（ii）将膜放在X射线胶片上并用轻微压力将其压平。
（B）通过荧光照相检测3H，35S，125I或14C标记的RNA
（i）将膜浸入含PPO的甲苯溶液中。
（ii）膜在空气中自然干燥。
（iii）将膜置于X射线胶片（Kodak RP-Royal Xomat）上并保持在-70℃。

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