小分子靶点鉴定

摘要

小分子药物( Small Molecule Drug )在进入动物体内或细胞时,通常作为信号传导抑制剂(极少数是激活效应) , 它能够特异性地干扰或抑制增殖过程中所必需的信号传导通路, 从而阻断肿瘤生长。因此研究小分子化合物结合的靶蛋白,进而确认与靶蛋白的结合方式及位点,有助于揭开小分子化合物的作用机理。

随着化学蛋白组学的发展，越来越多的技术被用于小分子靶点鉴定。本文主要归纳整理了标记法和非标记法这两大类靶点鉴定方法。

一、标记法

标记法是将小分子化学改造为具有标记能力的探针，通过荧光成像或富集技术，鉴定其作用靶点蛋白。目前最具代表性的是基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling，ABPP）。他可以在复杂的蛋白质组体系中直接获取某类蛋白质的活性功能信息。ABPP技术的核心是设计可以在复杂生命体系内与靶标蛋白活性中心氨基酸残基结合的“活性分子探针”（Activity-based Probe, ABP）。

ABP可以分为活性基团和报告基团两部分：
活性基团即反应基团，是活性分子探针的核心，可以与蛋白质组学中的靶标蛋白结合。但对于无法和靶标蛋白共价结合的探针，可以引入光亲和力标记（photoaffinity Labeling，PAL），基本思路是在化合物中引入光交联基团，通过该技术可以帮助标记细胞或者细胞裂解液中低丰度或与探针亲和力较弱的靶标蛋白。

报告基团有罗丹明、荧光素等荧光基团以及生物素。荧光基团可以对靶标蛋白进行可视化、高通量检测；生物素可以通过与链霉亲和素反应富集靶标蛋白，然后进行质谱分析。

标记法的核心是对小分子的结构进行修饰，以下介绍三种构建化合物活性探针的方法。

1.1通过引入生物素标签构建探针

该方法的大致思路是通过对小分子结构进行修饰，引入生物素分子标签作为报告基团构建靶标-化合物-标签，用SA进行富集从而实现小分子靶标的富集以及鉴定。

1.2通过引入炔基或叠氮构建探针

诺贝尔奖技术点击化学，该技术的原理为在尽可能小地改变化合物生理活性的前提下引入相对分子质量较小的炔基或者叠氮，利用铜催化的叠氮-炔基环加成反应或者环张力诱导的叠氮-炔基环加成反应等生物正交反应，将生物素、荧光素等其他报告基团连接在探针上实现对小分子化合物靶标蛋白的富集以及可视化，这种方式使得探针能够更好地模拟小分子在细胞内的作用模式。

1.3针对活性氨基酸残基的分子探针

二、非标记法

非标记法是基于中药活性成分和靶标蛋白结合后会影响靶标蛋白的热稳定性、氧化速率等生物物理性质，进而识别中药活性成分可能作用靶点。非标记法不需要对小分子进行结构修饰，主要包括药物亲和反应的靶点稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）分析、氧化速率蛋白稳定性（stability of proteinsfrom rates of oxidation，SPROX）分析、蛋白质热稳定性分析（cellular thermal shift assay，CETSA）和热蛋白组分析（thermal proteome profiling，TPP）。

2.1 DARTS

DARTS技术的大致流程是细胞裂解、蛋白定量、加入小分子药物与裂解液共同孵育、蛋白酶水解，最后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白二维电泳（2D-PAGE）、胶染色技术、凝胶或非凝胶质谱技术、亲核色谱等多种方法对结合蛋白进行检测或鉴定。

2.2 SPROX

SPROX技术主要基于蛋白质和蛋白质配体的热力学稳定性，即在化学变性剂（如盐酸胍或尿素）浓度增加的情况下利用过氧化氢氧化蛋白质中的甲硫氨酸（氧化产物为甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜），用电喷雾或基质辅助激光解吸/电离质谱法测定特定氧化时间下甲硫氨酸的氧化程度与变性剂浓度的函数，未氧化产物、氧化产物变性剂关系曲线的交点为迁移中点，由于蛋白质和其配体结合后蛋白稳定性提高，与对照组相比，在相同浓度的氧化产物下需要更多的变性剂，从而导致迁移中点右移。SPROX优点在于不需要纯化蛋白，且可以与串联质谱标签（tandem mass tags，TMT）、细胞培养条件下稳定同位素标记技术（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）相结合，通过标记蛋白质氨基来确定肽的相对含量，以此扩大SPROX在全蛋白质组上的覆盖率。

2.3 CETSA

CETSA的大致流程为将多个等量的细胞裂解液或者组织匀浆液与小分子孵育，然后加热至不同温度进行热变性；冷却后，将样品离心，从沉淀蛋白中分离可溶性组分；通过Western blotting法对可溶性部分中的目标蛋白进行定量，或基于质谱方法根据其熔解曲线分析可溶性蛋白的热稳定性，从而确证小分子与靶标蛋白的结合。传统的热位移分析技术只能使用纯化的蛋白质，而CETSA的样本可以为细胞裂解液、完整细胞以及组织匀浆液等，极大地扩大了样品检测范围，使检测更方便快捷。

2.4 TPP

TPP将CETSA技术和基于多重定量质谱相结合，可以监测药物作用过程中整个蛋白组蛋白质热稳定性的变化，增加了在靶点和脱靶识别以及生物识别上的应用，实现对靶标蛋白的高通量检测。其大致操作流程为将细胞或裂解液在有无化合物条件下处理，然后将样本平均分成10份，在10个温度下分别加热，用PBS溶液提取可溶部分，再用胰蛋白酶处理样本并用TMT10进行标记，最后混合所有样本进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，得到的报告离子强度用于拟合曲线并计算每个蛋白质的特定熔解温度（Tm），从而找到稳定性差异蛋白。这种方法不仅仅能够检测细胞或组织中的蛋白质-配体相互作用，还可以检测不同状态下细胞蛋白质组的热稳定性。该方法适用于体外、原位和体内检测，已成功应用于药物靶点和脱靶识别、蛋白质代谢物和蛋白质相互作用的研究。

三、小结

综合标记法与非标记法来看，标记法的应用门槛较高，不适用于改造后活性丧失、化学合成困难以及微量的小分子研究。应用活性氨基酸残基探针进行研究时，只能针对与氨基酸残基具有共价结合能力的小分子，同时结合工具探针使用。但标记法也具备明显的优势，可以直接标记直接靶标蛋白，并通过后续蛋白变性的方法排除间接靶标蛋白，大大降低了靶点鉴定过程中的假阳性结果。非标记法的结果可信度不如标记法，同时很难排除药物结合蛋白所在复合体中其他蛋白的影响。但非标记法可以对任意小分子（包括微量活性成分）甚至多成分进行靶点鉴定。

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