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一、小分子 Pull down介绍

化学蛋白质组学技术,是利用化学探针,结合蛋白质组学,在小分子化合物与靶点蛋白质特异性结合的原理上,发现细胞裂解液或者活细胞中结合蛋白质的靶点,同时分析它们的药物可及性,快速得到全新结构的先导化合物,并了解它们的靶点选择性。用于小分子靶点发现、创新药物先导化合物筛选等研究。

小分子药物(Small Molecule Drug)在进入动物体内或细胞时,通常作为信号传导抑制剂(极少数是激活效应),它能够特异性地干扰或抑制增殖过程中所必需的信号传导通路,从而阻断肿瘤生长。因此研究小分子化合物结合的靶蛋白,进而确认与靶蛋白的结合方式及位点,有助于揭开小分子化合物的作用机理。

钟鼎生物化学蛋白质组学服务项目涉及以下三个实验:

1.小分子SM Pull down——发现与小分子特异性结合的靶点蛋白

2.MST(超链)——确认小分子与靶向蛋白的特异性及结合强度

3.结合复合物质谱解析——确认小分子与蛋白的结合的精准位点

化学蛋白质组学服务

二、小分子SM Pull down的核心思路


1.体外标记法

小分子化合物在体外偶联修饰生物素分子,不同的小分子化合物结构不同,标记修饰策略和难度各不相同,结构简单的可以直接反应,结构复杂的可能需要进行衍生化后修饰,钟鼎生物在小分子标记修饰技术上具备相当技术储备,有需求的客户可以将小分子的结构式发给相应的客服人员,我们会评估生物素修饰策略和成功率。

标记修饰生物素的小分子与蛋白裂解液充分孵育,有些项目中会分离特定的细胞器,例如核蛋白,线粒体蛋白、叶绿体蛋白等;同时会使用非标记的等量的小分子化合物和游离的生物素分子作为对照组平行试验。

链霉亲和素(Streptavidin SA)的磁珠特异性的捕获生物素分子,与小分子结合的蛋白会被同时亲和纯化洗脱,通过SDS-PAGE检测(使用灵敏度更高的银染)不同组别的蛋白差异情况。

洗脱下的蛋白先经胰蛋白酶消化成肽段,肽段在质谱仪中离子化后使用液质联用技术(LC-MS/MS)结合数据库检索可以进行蛋白定性,从而明确与小分子化合物结合的潜在靶标蛋白列表。

体外标记法
2.生物正交法

将小分子药物进行炔烃修饰,添加至细胞或组织中,甚至是实验动物体内,待药物分子与靶点蛋白充分结合,提取蛋白裂解液,通过点击化学反应,将叠氮生物素与小分子药物连接。

最后使用与体外标记法一样的策略,通过链霉亲和素捕获生物素分子,最终鉴定靶点蛋白。

生物正交法


三、案例展示(部分图片)



案例


四、文献解读

2022年10月,华东理工大学药学院李剑教授与上海九院眼科徐晓芳/贾仁兵教授团队合作在Acta Pharm Sin B(IF=14.903)上发表了题为“Cucurbitacin B-induced G2-M cell cycle arrest of conjunctival melanoma cells mediated by GRP78–FOXM1–KIF20A pathway”的研究论文,深入阐明了葫芦素B抑制结膜黑色素瘤直接靶点及作用机制。

客户文章

来自结膜黑色素瘤(CM)是一种罕见且致命的眼部恶性肿瘤。在这项研究中,科学家破译了一种名为葫芦素B的天然四环化合物(CuB),通过细胞学实验,发现CuB显著抑制CM细胞的增殖,对正常细胞无毒性。CuB也能诱导CM细胞G2/M细胞周期阻滞。

通过化学蛋白质组学实验,将CuB小分子修饰生物素,与CM细胞裂解液孵育,通过小分子pull down实验鉴定靶点显示GRP78是CuB的潜在靶点。体外原核表达证GRP78蛋白,并通过MST(微量热泳动)实验表明CuB与GRP78相互作用,并与Kd值结合0.11mmol/L。

客户文章

此外,ATP酶活性评估表明,CuB抑制了人重组GRP78蛋白和细胞裂解物中的GRP78。GRP78基因敲除诱导FOXM1和相关通路蛋白(包括KIF20A)的下调等一列关联现象。数据分析表明,CuB显著抑制NCG中的肿瘤进展而不会在体内引起明显的副作用。可以将CuB作为阻碍这一途径的候选药物进一步深入研究。

客户文章

五、方法学评价

  • 优势:
    1、相对于蛋白质芯片技术、小分子靶向蛋白分子显像技术,蛋白(多肽)展示文库筛选技术,小分子pull down实验操作简单,周期短,成本低廉。
    2、小分子与蛋白大多数为共价结合,特异性较强,结合紧密,实验结果复现率高,下游验证结合阳性概率较大。
    3、液质联用技术(LC-MS/MS)灵敏度可达pg级别,极其微量的蛋白能被分析出来.
  • 劣势:
    1、小分子结构简单且多样,结构即功能,修饰生物素的小分子,功能有可能发生变化,其结合的靶点蛋白与天然小分子发生偏移。
    2、偶联后的小分子化合物,如果要检测偶联效率和正确率,例如核磁共振或质谱法,所耗费的代价可能高于偶联实验本身的成本。
    3、质谱检测富集蛋白虽然灵敏,肽段的定位依据生信分析,只能实现初步的定性。


六、相关链接

相关服务

定量判断结合亲和力 MST微量热泳动

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