1.一步RT-PCR和两步RT-PCR方法哪个更好？应该怎么选择？

  一步RT-PCR的最大优点是操作简单，因此可避免样品间的交叉污染。但我们的实践经验表明，在大多数情况下，应首先考虑两步RT-PCR法，而不是一步RT-PCR法，因为 两步RT-PCR法产物的产量一般高于一步RT-PCR法；此外两步法具有更大的灵活性，可以分别优化RT和PCR两步反应，而无需考虑它们之间的干扰。

	一步法RT-PCR	两步法RT-PCR
反应	反应在同一体系进行	独立的逆转录和PCR反应
最佳应用	分析一种或两种基因，高通量检测	分析多种基因
时间/步骤	时间较短，无需开盖移液	时间较长，需开盖移液
试剂盒选择依据	操作简单方便、高通量、污染小	灵活、可获得cDNA

2.RT-PCR以总RNA作为模板还是以mRNA作为模板好？

  提取总RNA还是mRNA取决于实验目的。一般情况下（如克隆基因或比较不同样品间基因表达水平时），提取总RNA即可作为RT-PCR的模板。这样可以减少获得cDNA的实验步骤，从而减少实验误差。另外，分离总RNA要比分离mRNA少用一些试剂，因此更经济。但是若要构建cDNA文库，则需要分离mRNA作为模板，以便提高cDNA文库的质量。

3.如何保证作为RT-PCR实验模板的总RNA的数量和质量？

  RT-PCR能否成功的关键之一是提取的总RNA的数量和质量。要想保证获得高质量的总RNA,有两点需要特别注意：
(1)，Trizol试剂的选择。尽管有很多国内公司都提供 廉价的Trizol试剂出售，但我们还是强烈推荐购买质量更可靠的Invitrogen等公司的Trizol 试剂。
(2)，提取RNA过程，必须特别小心，严格按照要求操作，以防止RNA的降解。

4.如何防止提取RNA过程中RNA的降解？

主要注意以下几点：
(1)实验过程中使用的玻璃器皿使用前可于180 ℃干烤8h以上，塑料制品要用氯仿冲洗。焦磷酸二乙酯（DEPC)是RNase酶的强烈抑制剂，RNA提取过程和反转录过程中所用的水要用DEPC处理。
(2)操作人员的手是RNase的重要污染源，进行RNA实验时应始终戴手套，并应勤换手套。
(3)提取的样品材料应尽可能新鲜，如果不能及时提取RNA，取样后应保存于液氮中。

5.如何选择反转录引物？

  两步法中反转录引物有Oligo（dT）（12-18个核苷酸组成）、随机六聚寡核苷酸和基因特异引物，可根据不同的目的选择不同的引物。Oligo（dT）引物能与哺乳动物mRNA的3'端poly（A）尾巴互补，作为一种通用引物用于cDNA第一链的合成。随机六聚寡核苷酸引物能与RNA模板的许多位点互补，因此，当RNA序列很长（＞3kb)或其中包含很多二级结构使Oligo (dT)或基因特异引物很难与mRNA互补时，选择随机六聚寡核苷酸引物不失为一种良策。

   基因特异引物能与靶mRNA的某一区域互补，该引物可用作 PCR反应中的下游引物。基因特异引物在细胞内靶mRNA含量较低时较为有用。

  当用基因特异引物进行反转录时，需注意引物的浓度和退火温度。一般而言，用Oligo (dT)获得的RT-PCR产物特异性比随机六寡核苷酸获得的RT-PCR产物的特异性高。一步法中所用引物为基因特异引物，因此选择余地比两步法少。一步RT-PCR中两条引物的其中一条既应在RT中发挥作用，又应在PCR中发挥作用。为兼顾RT和PCR,引物的退火温度一 般在45~65℃之间。为增加一步RT-PCR产物的量，引物浓度可增加到0.6μmol/L。引物最好设计在离mRNA 3' 末端4 kb区域以内，扩增长度小于1.5 kb。

6.RT-PCR的产物产率很低是什么原因？

  可能是因为反转录cDNA合成效率低，但更多情况下是因为cDNA扩增效率低。为了 验证后者的可能性，可建立一系列PCR反应，这些PCR反应中加入了不同数量的模板。 假如染色后的凝胶上呈现不清晰的成片状的非特异性条带，这种实验结果往往是在PCR 中加入过量的cDNA模板所致。因此，在许多PCR实验中用反转录反应产生的cDNA的 10%作为模板。在这种情况下，PCR扩增阶段需要另加模板。具体最适合的模板量，要靠预实验确定。一旦建立了模板的最佳浓度，其他的PCR参数可用系统的方式如改变 Mg²⁺浓度和复性条件来进一步优化。

7.上述调整后RT-PCR的产物产率依然很低，怎么办？

  可依次采取以下步骤：
(1)通过含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳来检査RNA的完整性。
(2)建立含有对照mRNA、Oligo (dT)引物和放射性元素标记示踪物的检测反应来检测CDNA的合成效率。
(3)将不同比例的RNA样品和对照样品混合，通过比较cDNA的产量来检测RNA样品中是否存在抑制剂。
(4)在继续进行PCR之前，纯化cDNA第一链的样品。

8.RT-PCR反应后，无PCR产物，怎么办？

  首先应严格按照说明书要求，进行Control反应。如果对照正常，说明实验操作方面没有问题。应从RNA样品的纯度和添加量、引物的设计情况、参考文献的可信度以及RT-PCR条件的设定等方面加以考虑；如对照反应不正常，应从实验操作的准确性、实验器具的处理、PCR仪的条件设定等方面加以考虑。

9.有些RT反应体系中，不加dNTP混合物，为什么？

  由于在这些RT反应体系中已经加了足够量的dNTP Mixture,因此在PCR反应中，不须再添加dNTP。如果在PCR反应时继续添加，虽然PCR反应仍可进行，但可能会降低 DNA的扩增效率。

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