钟鼎生物技术公司基于与客户合作的实际案例，介绍了RT-PCR的实验流程，包括RT-PCR实验所需试剂耗材、RNA提取、RNA反转录为cDNA。

实验摘要

使用TRIzol提取样品总RNA，反转录获得cDNA，供下游实验使用。

1.试剂与耗材

试剂与耗材
Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，宝生物工程（大连）有限公司，6210B；	总RNA提取试剂TRIzol，南京钟鼎生物技术有限公司，RK01-100；
DL2000 DNA Plus Marker（100、250、500、750、1000、1500、2000 bp），南京诺唯赞生物技术有限公司，MD101。	GelStain，北京全式金生物技术有限公司，GS101-01；
DEPC，Sigma公司，D5758-25ML；	Agarose，西班牙Biowest，91622；
离心管，美国Axygen，311-01-051；	枪头，美国Axygen；
其它试剂均为国产分析纯。

2.主要实验仪器

主要实验仪器
超微量紫外分光光度计：NanoDrop2000，Thermo公司；	台式高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司，Allegra 21R；
电子天平，美国AHOMS公司，AR5120；	紫外透射仪，美国Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25；
电泳仪：TY2795型，BIO-RAD公司；	电泳槽：Sub-Cell GT Cell，BIO-RAD公司；
凝胶成像分析系统：GelDocXR型，BIO-RAD公司；	雪花状制冰机，日本SANYO公司，SIM-F140AY65；
移液器，德国Eppendorf公司。

3.实验方法及结果

3.1.RNA提取

（1）组织匀浆：向样品中加入1 ml TRIzol试剂（组织块体积不要超过TRIzol体积的10%），用移液器反复吹打。

（2）将上述匀浆液室温放置5 min，待核酸和蛋白充分解离。每1 ml TRIzol试剂用量的匀浆液中加入0.2 ml氯仿，盖紧管盖，手动剧烈震摇15 s，然后室温静置2～3 min。

（3）4℃ 10,000 g，离心10 min。

（4）小心吸取上层水相（无色）加入到新试管中，同时计算所吸取的水相体积。

（5）加入所吸取水相等体积预冷的异丙醇，盖紧管盖，轻轻摇匀。

（6）室温静置10 min，待RNA充分沉淀。

（7）4℃ 10,000 g离心10 min。

（8）将上清弃除（注意别丢弃沉淀），每管加入1 ml 75%乙醇润洗，盖紧管盖，轻轻晃动离心管，以去除残留的异丙醇和盐份。4℃ 7,500 g离心5 min。

（9）将上清弃除，打开管盖，将RNA 沉淀干燥（室温挥发或真空干燥）。注意RNA沉淀不可完全干燥，否则难以溶解。

（10）将RNA沉淀溶解于适量的无RNase水中。

3.2.RNA琼脂糖凝胶电泳分析

提取好的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图如下所示：

3.3.RNA浓度及纯度测定

3.4.RNA反转录为cDNA

3.4.1.基因组DNA去除

采用钟鼎公司的DNase I，在RNase free的离心管中配制如下混合液：

3.4.2.反转录反应

在PCR管中配制下列反应混合液：

65℃反应5 min，冰浴冷却。

在第一步的反应管中配制下列反转录反应液：

反转录反应条件的设置：30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min。冰浴冷却。产物至于-20℃冰箱保存。

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