RNA pull down原理

    RNA沉降（Pull down）主要是检测蛋白质与RNA之间的相互作用。首先把已知序列 的RNA做好标记(例如biotin)，依靠这个标记将RNA固定到某珠子(Beads) 上，再和含有蛋白质的物质，例如细胞裂解物共孵育，之后去掉未与RNA作用的上清。收集从珠子上洗下来的蛋白质，如果蛋白质是未知的，则要去作质谱鉴定;如果想知道是不是某蛋白质，则要作Western Blot鉴定。

基本思路

    研究蛋白质与RNA之间的相互作用，大致有两种思路:①将RNA耦联于珠子以富集与之相互作用的蛋白质;②用蛋白特异的抗体去免疫沉淀蛋白质，再通过提取蛋白复合体中的RNA,利用QT-PCR等方法以检测与之相互作用的RNA。

1. RNA耦联珠子以富集与之相互作用的蛋白质

  (1)高碘酸盐耦联法
  ①RNA-高碘酸盐反应。
  a.配制以下反应体系。
  500 pmol RNA (100 个碱基的RNA 15μg，25个碱基的RNA4μg)
  40μL 1mol/L CH₃COONa pH=5.0
  20μL 0.1mol/L高碘酸盐(溶于水且新鲜配制)
  补水至400pL。
   b.室温，置于旋转仪上孵育1h (反应管外包裏铝箔纸)。
   c.加80μL 1mol/L CH3COONa (pH=5.0)，再加1mL 100%无水乙醇，-20°C，静置1h。在此期间，开始准备珠子。
  d. 4℃，12000r/min, 10min， 70%乙醇洗一次后干燥;将干燥好的RNA沉淀用100μL CH₃COONa (0.1mol/L)重悬。
  ②准备珠子。
  a.将100μL乙二酸去异烟肼琼脂糖珠(含50%上清)在10mL离心管中洗涤，10mL0.1mol/L CH₃COONa (pH5.0)洗3次，每次4℃，3000r/min, 5min,弃上清。
  b.用200μL 0.1 molyE CH₃COONa (pH=5.0)重悬样品。
  ③RNA-珠子结合反应。
  a.将之前准备好的300μL珠子加入高碘酸盐处理好的RNA中。
  b.4℃置于旋转仪上避光结合过夜(反应管外包裹铝箔纸)。
  c.4℃, 3000r/min, 5min,去上清，用1mL 2mol/L NaCl洗2次，然后将样品移至1.5mLEP管，4℃，3000r/min, 5min, 弃上清。
   ④接下来，可选方案1或方案2。
  方案1如下。

  a.洗RNA结合的珠子。
•用1mlL缓冲液D洗3次，4C，3000r/min, 5min，弃上清。
•100μL缓冲液D重悬。

缓冲液D配方：20ml	40μL	HEPES
	2mL	KCI
	4μL	EDTA
	20μL	DTT
	1.2mL	甘油
	20μL	酶抑制剂

b. RNA-Protein 结合反应。
•准备500μL RNA样品反应体系。
300μL缓冲液D
100μL目的蛋白（10-15μg/μL）
肝素(100μg/μL 储存液稀释至终浓度0.5-2.5~5.0μg/μL)
加酶抑制剂，按1:1000加。
补水至500μL。
•摇晃混匀。
•旋转仪上孵育4h (4C)。
•4°C, 3000r/min, 5min, 尽可能弃去上清。
•1mL缓冲液D洗3次，每次置于旋转仪上5min,去上清。
•加入50μL 2 X SDS.上样缓冲液，煮样10min,行Western Blot。
a.洗RNA结合的Beads
•用1.0mL缓冲液B，4°C 3000r/min, 5min,弃上清。
•100μL 缓冲液B重悬。

缓冲液B配方:	5mmol/L	HEPES	pH 7.9
	1 mmol/L	MgCI2
	0.8mmol/L	乙酸镁

b. RNA-蛋白质结合反应。

•准备500μL RNA样品反应体系。

50μL 10X结合缓冲液。

100μL目的蛋白(10-15μg/μL)

100μL结合了RNA的珠子

肝素(100μg/μL 储存液稀释至终浓度0.5-2.5~5.0μg/μL)加酶抑制剂，按1:1000加。

补水至500μL。

轻轻摇晃离心管，于旋转仪上孵育30min,室温。

•4℃，3000r/min,5min,尽可能弃去未结合的蛋白混合物。

•Buffer B洗5次(1mL)，4℃, 3000r/min, 5min，弃上清。

•加人50μL 2XSDS上样缓冲液，煮样，行Western Blot。

2.生物素-磁珠耦联法

(1)实验原理

    使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链酶亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

(2)需要的试剂

亮抑酶酞，抑酶酞，胃酶抑素，HEPES等

(3)实验步骤

①胞浆蛋白提取。100mm培养皿(6X106细胞)，去培养基→PBS洗2次→沉淀用0.5mL胰蛋白酶消化加人PBS 2mL,反复吹打收集细胞，转移至EP管，3000r/ min离心2min,弃上清，PBS重复洗1次。加人100μL缓冲液A，吸打混匀，冰浴15min。 加人缓冲液A (含2.5% NP40) 12. 5μL,轻缓颠倒混匀6次，4°C，4000r/min离心5min,上 清用于胞浆蛋白分析。

②探针标记。Promega 试剂盒，Maxiscript T7 Kit, # 1312。

a.205mmol/NTP Mix。

b.体外转录反应。

c.探针纯化。

③沉降。

a.珠子处理。

b.Pull-down

c.煮样，行Western Blot。

3.通过免疫沉淀蛋白以富集与之相互作用的RNA

(1)6盘10cm皿已经长满的细胞。

(2)DEPC处理的PBS洗3遍，10mL/遍。最后用4mL PBS刮下细胞，并将细胞吹散。

(3)将细胞转移至5mL离心管中，2000r/min 离心5min,弃上清。

(4)加人2mL (根据细胞量确定)免疫共沉淀缓冲液，吹匀细胞。冰上裂解20~30min，期间用1mL枪和2.5mL注射器将细胞裂解液吹散，使反应充分进行。

(5)将细胞裂解液转移至2个2mLEP管中，12000r/min最高转速离心20min离心后取上清。

(6)开始准备protein A/G珠子，取100pL珠子于1.5mL EP管中。用免疫共沉淀buffer洗3遍，再加人100μL免疫共沉淀缓冲液，将珠子均匀悬浮其中。

(7)将准备好的beads与第(5) 步中的上清混合，4C旋转1h。

(8)离心后，吸出液体，将液体平均分到2个EP管中，分别加入4μg抗体和NormalIgG，并都加入2μL RNase抑制剂，混匀，4℃，旋转过夜。

(9)准备100μL珠子，方法同(6)，加入5μL RNase抑制剂(可选)。

(10)将(9)中的珠子每管加入26μL。4°C反应L5h。

(11) 用免疫共沉淀缓冲液洗珠子，洗5遍。

(12) Trizol提取RNA。

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