从细胞里提取出完整RNA并进行纯化，是进行许多基础分子生物学实验研究RNA功能机制方面的研究的首选和关键步骤。包括cDNA文库构建，northern杂交,检测细胞的转录水平,定量PCR,RT-PCR及体外翻译等。本文将会介绍RNA提取实验步骤，供大家参考。

1.方法背景

  从组织或者细胞中提取总RNA的方法是用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，异硫氰酸狐是一种常见且有效的蛋白质变性剂，在裂解细胞的同时能有效抑制内源性RNA酶活性。同时加入氯仿产生了第二相（有机相），DNA和蛋白质在有机相中被抽提，低pH值的酚将使RNA留在上层水相中。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩, 随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，最终获得总RNA。

1.细胞或者组织样品匀浆处理

(1)贴壁培养细胞：细胞量为10⁷,无须用胰蛋白酶消化，在去除培养液后，用预冷无菌PBS洗细胞一次，去上清，再加入1mL单相裂解液裂解细胞，可用枪头吹打混匀，使细胞裂解完全，最后转移到1.5 mL离心管。

(2)悬浮培养细胞：细胞量为107,可直接转移到15 mL离心管，500 rpm离心5 min 后；用预冷无菌PBS洗涤1次，弃上清，再加入1mL单相裂解液悬浮细胞沉淀，可用枪头吹打混匀，使细胞裂解完全，最后转移到1.5 mL离心管。

(3)组织样品：解剖所要的组织后，先将这些组织切成小块（100 mg),然后将组织放入盛有液氮的研钵中，用研棒磨碎组织，使组织成粉末状。在研磨过程中要不断添加液氮使组织保持冷冻状态，最后加入1mL单相裂解液裂解组织细胞，再转移到1.5 mL离心管。

2.RNA提取

(1)样品加入单相裂解液后，室温放置5 min,使样品充分裂解。如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。
(2)如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖等，12000 rpm离心5 min,取上清。
(3)按每1mL单相裂解液加入200 μL氯仿，振荡混匀后室温放置15 min,使其自然分相。禁用旋涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
(4)4 ℃ 12 000 rpm离心15 min后，样品会分成三层，黄色的有机层，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中。
(5)小心吸取上层水相，至另一个新的1.5 mL离心管中。不要吸取中间界面，以免DNA和蛋白污染。
(6)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，-20 ℃放置1h以增加RNA沉淀。
(7)4℃ 12 000 rpm 离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
(8)RNA沉淀加入1mL 75%乙醇（用DEPC水配置），温和振荡离心管，悬浮沉淀。
(9)4℃ 8 000 rpm离心5 min,尽量弃上清。用移液器小心吸弃上清，注意不要吸走RNA沉淀。
(10)室温晾干5〜10 min,让最后残存的痕量乙醇挥发。RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
(11)用50 μL DEPC水或者TE溶解RNA沉淀，RNA溶液要放在-70℃保存。纯水和TE均需DEPC处理并经高压消毒。

3.RNA定量

  RNA提取完就应该来做RNA定量，RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260 nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260 nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40 μg/mL的单链RNA。如用1cm光径，用ddH₂0稀释DNA样品n倍并以ddH₂0为空白对照，根据此时读出的OD₂₆₀值即可计算出样品稀释前的浓度：
  RNA (mg/mL) =40x (OD₂₆₀读数）x稀释倍数(n)/1000
  纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8-2.0,根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值可以估计RNA的纯度。若比值比1.8低，说明有残余蛋白质、酚或者其他杂质存在；比值比2.0高，则提示RNA有降解。

4.RNA凝胶电泳

  RNA的电泳目的是检测28S和18S条带的完整性和它们的比值，或者是mRNA Smear 的完整性，可以用普通的琼脂糖胶进行。如果28S和18S条带明亮、清晰，没有出现涂抹状片段，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则可判断认为RNA提取的质量是好的。

5.保温实验

保温实验主要是来检测RNA酶的存在，关于RNA检测以及RNA酶的检测可以参考另外一篇《如何检测RNA》

6.材料与试剂

6.1.试剂

单相裂解液（4 mol/L的异硫氰酸胍，0.1 mol/L的乙酸钠，0.2% β-巯基乙醇，50%饱和酚），氯仿（分析纯），异丙醇（分析纯），75%乙醇（用0.1%的DEPC处理过的无RNA酶的水稀释），DEPC·H₂O,TE溶液（10 mmol/L的Tris·HCl，pH8.0，1mmol/L的EDTA），PBS（1×），焦碳酸二乙酯（DEPC），液氮。

6.2.仪器设备

冷冻台式离心机，电泳仪，电泳槽，电热恒温水槽，紫外分光光度计。

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