众所周知，RNA提取过程中最重要的注意事项是防止RNA酶的污染导致实验失败，除此之外，本文将会整理一些实验技巧供大家参考，帮助大家提取更高质量的RNA。

(1)皮肤携带的细菌霉菌等微生物及人体自然脱落下来的皮屑，都可能成为RNA酶的来源，从而影响RNA的提取。因此要培养良好的无菌操作习惯，预防微生物污染。
  使用灭菌的一次性的塑料器皿提取RNA，避免使用公共仪器（公共仪器或多或少都会含有RNA酶，特别是在进行DNA操作时有时要加入RNA酶）， 消化DNA样品中所含的RNA。用过RNA探针的实验室，可能用RNA酶来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的公共实验用具可能富含RNA酶。

(2)操作时勤换手套，戴手套口罩，冰上操作，动作迅速。最关键的一步也是决定RNA质量的一步是：加氯仿离心后，出现分层，RNA在上清中，中间是DNA,下面是蛋白。这里一旦不留意，中间的DNA就会混入，从而影响RNA质量。
  乙醇清洗后，务必完全去除乙醇（至无乙醇味），否则会影响电泳时上样。异丙醇-20℃沉淀 RNA 30 min以上。这里要提一个小技巧，就是在加入氯仿离心后，一般上清液的量约占总体积的50%。为了提髙RNA的质与量，离心后不要马上吸取含有RNA的上清液，而是移取中层的DNA和下层的蛋白。余下的下层油相（10%~15%），经短暂高速离心之后再吸取上清含有RNA的水相。因为当下层油相占很少体积时，上下层的界面所占的体积少，不会造成水相太多的浪费，吸入中间蛋白相和下层油相的可能性也会很小。其实这一技巧可用于所有的分层液相的实验，如酚抽提DNA的实验，回收胶中DNA的实验。

(3)在提取细胞样品的时候，不能在细胞离心后马上加入Trizol试剂。因为成团的细胞加入Trizol试剂后，外围细胞先期施放出的大分子DNA，聚积成团，干扰成团里层细胞的裂解，即使用加样枪或针头反复吸取，也无法彻底打断已经成团的DNA。
  如果提取样品来自培养的贴壁细胞，吸取培养基后用PBS洗涤细胞两次，直接加入Trizol试剂； 如果提取样品来自培养的悬浮细胞，连培养基一起吸取离心，用PBS洗涤细胞两次，最后加入5%~10%的PBS重悬细胞沉淀，等到重悬完全后再加入Trizol试剂。
  在提取组织样品时，就得充分研磨组织，等组织块成为粉末后再加入Trizol试剂。常用的研磨方法是液氮研磨法。因为液氮变为气体时要吸收大量的热，使组织块瞬间冷冻。但如果冷冻不透，液氮研磨材料时，会得到干渣并黏在研钵内壁，而不是干粉，无论是产量还是质量都次之。因此，这一过程中有三个关键步骤：
①研磨器皿高压灭菌烘干水汽后，-80℃放置过夜，预冷冻；
②组织块的表面积尽可能大，切不可成球状，一旦用力研磨，球状的组织块极易飞出研钵；
③加人足量的液氮让组织块完全冻透，一次将组织块研磨好。在没有冻透之前千万不能研磨，如一次没有研磨好，下一次研磨的效果就差，且第二次加入的液氮会将前一次所产生的干粉带出研钵，使其飞溅在研钵的四周。这一技巧同样可用于分离提取组织块的DNA或蛋白质。

(4)使用Trizol试剂时，其中的一种成分能抑制RNA酶，所有RNA样品泡在Trizol试剂中是不可能被RNA酶消化的。但是，对样品的后续操作会要求用无RNA酶的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150℃的烘箱中烘烤4h。塑料器皿可以在0.5mol/L 的NaOH中浸泡10 min,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

(5)用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA时，原则上是要根据沉淀的多少加入相应的体积，考虑到新手一开始经验不足，可以少加，浓度大可以再稀释。
  提取完RNA后跑电泳检查有无DNA污染和RNA降解，然后-80℃保存。实验后要注意：超净台需用70%乙醇擦拭，再用 DEPC或Erasol除去空气中的RNase，提取RNA所需的Tip和EP管要提前用0.1%的DEPC或Erasol水处理以除去RNase，DEPC处理还需高压。其实RNA贮存在70%的乙醇中，远远要比贮存于DEPC水中稳定，在-80℃可保存数年，有些甚至10多年后还可以用。有两种操作方式：
①乙醇或异丙醇沉淀后如不马上要用，直接换成70%乙醇，-80℃保存，用时再来分析RNA的质量和数量；
②常规的处理后，了解RNA的质和量，再加入3倍体积的无水乙醇，再-80℃保存。
  当然，这两种贮存方式都要在RNA不是马上要用的前提下进行。如果提取的RNA比较多，可以先留取一部分样品进行马上进行的实验，另一部分贮存于70%乙醇，以备后用。

(6)Trizol试剂提取RNA所用到的一次性试管要确保没有破损，能够耐受12000g的离心力。
  实验用水相当重要，必须用DEPC处理过的无RNase水。配制过程是在去离子水中加入0.1%的DEPC,摇过夜之后，高压分解残留DEPC。。提取时，所有与Trizol试剂有过接触的器皿都要泡存水中，吸取出来的Trizol试剂也要直接加入含有大量水的玻璃杯中。

(7)Trizol提取RNA时要注意戴手套和护眼罩，因为Trizol试剂含有酚等有机溶剂。操作要在通风橱完成，避免人呼吸道吸入。同时温度应该控制在15-30℃。

相关阅读：
《RNA提取实验步骤》
《植物组织RNA提取》