截止2011年，全球包括我国在内的29个国家总共种植了近1亿6千万公顷转基因作物。其中，我国种植面积位列全球第6,达到360万公顷并具有稳定上升趋势。转基因技术将为我国的农业现代化和粮食安全提供强大的动力和有力的保障。水稻是我国主要的粮食作物，全国有60%以上的人口以大米为主食。本实验手册仅以转基因抗虫水稻为案列来讲述水稻转基因材料的一般步骤。

1. 采用农杆菌介导遗传转化, 产生转基因植株超过500株，于温室经炼苗后移栽至实验田(此时转基因苗为T₀代植株):

2.在苗期采用小样法提取转 基因植株基因组DNA, 进行PCR阳性检测， 粳稻潮霉素阳性率一般可以达到90%，籼稻或者是其他筛选剂略低(图1);

图1 PCR阳性检测图片

3. 在分蘖盛期采用大样法提取转基因植株基因组DNA,进行southem拷贝数检测(图2)，单拷贝率一般为 20% (单拷贝植株有利于后续的遗传分析);

图2 southern杂交拷贝数检测

4.对单拷贝植株进行初步的株型鉴定， 对明显突变植株进行剔除(矮化，黄化和白花等等):

5.在 孕穗期对株型正常单拷贝植株进行RNA水平表达量检测，方法可用半定量RT-PCR, northern杂交和定量real-timePCR。分别选取低，中和高表达量植株各10株以上，用于后续表型鉴定，在能保证育种目标的前提下尽量选择低量表达的家系，这样既可以延长目标性状的时效性(如减慢抗性虫系的产生)，同时也可减少植物的生理负担;

6.在抽穗期对目标基因进行蛋白水平表达量检测，方法可以采用westerm或者ELISA;

7.在抽穗期对选取的植株进行表型的初步鉴定，如抗虫或抗除草剂效应;

8.在抽穗晚期至成熟期进一步 剔除突变植株(主要是不育植株)，单株收种:1至8步实验要在T₀代当季完成，选取目标性状明显，表达适中的株系进行下季实验;

9.T1代植株种植，每家系种植24株，条件允许可以进行适量的表型鉴定和PCR阳性检测并考察家系内的表型分离情况，成熟后单株收种:

10.筛选剂发芽实验，目的是每家系选取2-3个纯合植株(图3);

图3 发芽实验筛选纯合植株

11.纯合植株T₂代种植，每家系种植24株(原品种，非转基因对照也一起种植)，当代完成全生育期基因表达量检测和表型检测，单株收种(图4);

图4 田间表型鉴定

12.考种，统计结果与野生型农艺性状基本-致，同时目标性状良好材料进行后续实验;

可以根据考种结果，如果农艺性状变异较大可以加2次回交实验和2次自交实验，这样可以尽可能剔除因组培过程导致的细胞质变异。

13.T₃/BC₂F₃代种植(野生型和4-6个各性状优良材料)，进一步聚合以及繁种，为下一代进行随机区组实验，根据情况可以每家系混合收种:

14.T₄/BC₂F₄代随机区组实验，设置3-4个重复，每个重复每家系种植2*12|+24株，期间进行完善的田间表型鉴定。去掉两侧4株(边缘效应)，单株收种20株:

15.考种，并统计详细统计各农艺性状结果，选取性状优良家系23个进行后续的实验;

16.T₅/BC₂F₅代种植，目的主要是繁种。当季实验较少，通过前期实验的严格筛选，转基因家系材料也较少，可以进行插入位点的侧翼序列的分离，详细了解转基因植株的插入事件特点，为后续的安全性评价实验储备材料;

以上1至16步实验主要属于转基因科学实验部分，实验规模较小，-般不需要向主管部门申报，只需要备案即可(但是还是需要严格控制实验条件，防止材料扩散等等)。以下实验生物安全性评估实验，必须按要求提供各项材料向转基因主管部门申请并获得许可后实施。

17.中间实验

试验地点和规模:不超过2个省(市、区), 每省不超过3个点。种植规模不超过4亩。试验地点应当明确试验所在的省(市、自治区)、 县(市)乡、村、试验年限:一般为一至二年;

18.环境释放实验

试验地点和规模:不超过2个省(市、自治区)每省不超过5个点。种植规模不超过4~30亩。试验地点应当明确试验所在的省(市、自治区)、 县(市)、乡、村。试验年限: 一次申请环境释放的期限一般为一至二年:

19.生产性试验

试验地点和规模:应在批准进行过环境释放的省(市、 自治区)进行，不超过2个省(市、自治区)，每个省不超过3个点。种植面积大于30亩。试验地点应当明确试验所在的省(市、自治区)、县(市)、乡、村。试验年限: -次申请生产性试验的期限一般为一至两年;

17-19步期间应该按要求，由主管部门委托机构进行安全评价，包括食甪安全评价(营养学评价;毒性学评价;致敏性评价;标记基因安全性(抗生素抗性)评价;重金属与农药残留对人类的长期非预期效应。)和环境安全评价(生存竞争力;基因漂移;对靶标生物及非靶标生物的影响;对生态环境的非计划性后果。)

20.安全证书的申报;

21.申报获得品种证书;

22.商业化生产制种。

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