自限制性内切酶被发现以来,其作为人们操纵DNA分子的主要工具,大大推动了分子生物学的发展,并且获得了"分子刀"的美誉,本文将会介绍限制性内切酶的特性,分子生物学运用限制性内切酶的常规实验(包括单酶消化单DNA样品、消化多个样品、多酶消化DNA样品与限制性内切酶的常用辅助手段DNA甲基化的操作),限制性内切酶反应的常见问题及注意事项。

一、实验方案

1.单限制性内切酶对单DNA样品的消化

1.1材料试剂

DNA样品（溶解于TE或ddH₂o中），10x限制性内切酶缓冲液，限制性内切酶, ddH₂o, 0.5mol/L 的 EDTA (pH8.0)(选用），3mol/L 的 NaAc (或5mol/L 的乙酸铵） (选用），无水乙醇（选用），酚（选用），氯仿（选用）。

1.2实验步骤

  以下以20μl反应体系说明单限制性内切酶对单DNA样品消化的实验过程。一般而言，20μl反应体系对于电泳分析来说比较方便。

(1)推荐使用灭菌的离心管来进行酶切反应。
(2)20 pL体积的反应体系如下：
DNA 0.2~1 μg
10 x 酶切 Buffer 2.0 μL
限制性内切酶1~2U (单位）
加ddH₂o调节至20μL。限制性内切酶最后加入，注意酶不宜暴露于室温中过久，否则会导致酶活性下降。

(3)混匀，稍加离心，置于适宜温度水浴（一般是37℃）并按所需的时间（一般1h）温育。
(4)需要电泳回收的酶切片段，反应体系总体积可达50~200 μL，只要反应体系中其他成分的比例保持一定。 (5)若要终止酶切反应，加人0.5mol/L的EDTA (pH8.0)使终浓度达10mmol/L，或将离心管于65℃水浴放置10 min，或加入20%反应体积电泳加样缓冲液，均可使限制性内切酶灭活。终止反应后，产物放于-20℃备用。
  EDTA通过螯合镁离子而终止反应，很多酶在65℃放置10 min可被不可逆灭活，有的酶不能在65℃灭活，这时将其置于75℃温育15 min也可以将其灭活，如果酶对热具有完全抗性，可用酚抽提和乙醇沉淀或硅基质悬浮法来纯化DNA。
  如果酶切反应体系体积过大，以至于电泳时加样孔盛不下，可对酶切产物进行浓缩。 具体方法如下：终止反应后，加入1/10体积3mol/L的NaAc (或0.6倍体积的5mol/L 的乙酸铵）和2倍体积无水乙醇，置于冰上5 min，然后于4 ℃ 12 000 g离心5 min,去上清液（含大部分蛋白）。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH7.6)。
(6)如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1:1)和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。

2.消化多个DNA样品

  当需要消化多个DNA样品时，吸取的次数可能会比较多，这样既浪费时间，也提高了污染的风险，以下步骤可减少实验过程中的吸取次数。
(1)分别向不同的离心管中加入相同体积的各个DNA样品。
(2)另取一离心管，向其中加入足够消化所有样品的10x反应缓冲液和ddH₂o, 混匀。
(3)向“混合液”中加入足以消化所有样品的酶，混匀，置于冰浴。
(4)取适量“混合液”分别加入各装有DNA样品的离心管中，进行温育。
(5)按需要终止反应及进行相关操作。

3.多限制性内切酶消化DNA样品

  经常遇到需要一种以上的限制性内切酶来消化DNA的情况。此时，若几种酶具有相同的反应条件，可向同一反应体系中同时加入多种内切酶，实验过程可参考1.2。然而，许多限制性内切酶在以谷氨酸钠和醋酸钾为基础的缓冲液中具有不同的活性，这时，如果所需反应条件相差太大，可参照以下步骤进行。
(1)参照1.2加入需要较低浓度NaCl的酶消化底物，若反应体系体积为20μL， 则加入1~3 μL 1mol/L的NaCl，使NaCl终浓度适合另一酶反应，加入该酶继续消化。
(2)按需要终止反应及进行相关操作。

4.限制性内切酶对DNA的部分消化

  事实上DNA分子的四种核苷酸含量并不是相等的，其排列顺序也并不是随机的，因此实际上限制性内切酶的消化效率要低于其完全消化的效率。此类不完全的限制性内切酶消化被称作限制性内切酶对DNA的部分消化。在部分消化的条件下，DNA分子中只有部分的限制性位点被切割。通过缩短酶切反应的时间，降低反应的温度，或对酶进行稀释来约束酶的活性，都可以达到部分消化的目的。部分消化在用特定的限制性位点进行克隆或构建酶切图谱时特别有用。
(1)配制100 μL含DNA样品和1x酶反应缓冲液的混合物。分别将混合物加入不同的离心管中，其中管1加30 μL,管2~管4各加入20 μL,管5加入10 μL，置于冰浴。
(2)加入所选用的酶至管1 (3~10 U/μg DNA),混匀，置于冰浴。从管1中吸取 10 μL至管2中，快速混匀，置于冰浴。依次连续稀释，从管2至管3,管3至管4,管4至管5,最后每个管的体积均为20 μL。
(3)每个管在合适温度温育15min后终止反应。（见下图）

5.DNA甲基化

  DNA的甲基化常常作为酶切的辅助手段被运用于分子生物学实验中，许多商品化的甲基化酶可将甲基以共价键结合到特定靶序列的腺嘌呤和胞嘧啶上，这些甲基化的位点不能被限制性内切酶所切割

5.1材料试剂

DNA样品，甲基化酶，10×甲基化酶缓冲液，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）

5.2实验步骤

(1)取20μL甲基化酶缓冲液，加入DNA（终浓度为 20~200 μg/mL）。
(2)加入SAM充当甲基供体，终浓度为80 μmol/L。
(3)加入足量的甲基化酶，使DNA免受相应的限制性内切酶切割，1 U甲基化酶在合适条件下可保护1 μg的DNA。
(4)在合适温度下（一般为37℃）温育1h。

二、注意事项

1.DNA纯度

  DNA本身的纯度很大程度上决定了限制性内切酶的反应效率。DNA制剂中的蛋白质、乙醇、酚、氯仿、EDTA、SDS以及高盐离子浓度等，都可能会抑制酶的活性。可用以下方法克服：①增加酶的量②增大酶反应体系的体积，使抑制因素被相应地稀释；③延长酶反应时间。

  对于DNase污染来说，由于DNase的活性依赖于Mg²⁺的存在，而一般溶解DNA的TE溶液中含有EDTA,它可以螯合镁离子从而抑制DNase的活性，这时DNA还是稳定的。 当加入了限制性内切酶缓冲液后DNA会被迅速降解。要避免这种情况发生，唯一方法就是使用高纯度的DNA。

  在反应混合物中加入适量的聚阳离子亚精胺（一般终浓度为1~2.5mmol/L)，有利于限制性内切酶的消化作用。但注意亚精胺在4℃下会促使DNA沉淀。

2.DNA甲基化程度

  限制性内切酶是原核生物限制一修饰系统的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用会强烈地影响酶的活性，抑制其在该些位点产生切割。通常从大肠杆菌寄主细胞中分离出来的质粒DNA,都混有两种作用于特定核苷酸序列的甲基化酶，一种是dam甲基化酶，催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化；另一种是dcm甲基化酶，催化CCA/ TGG序列中的胞嘧啶残基甲基化。因此，从正常大肠杆菌菌株中分离出来的质粒DNA只能被限制性内切酶部分消化，甚至完全不被消化，是属于对甲基化作用敏感的一类。为了避免产生这样的问题，在分子生物学中通常使用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。不同位点间的甲基化程度是不一样的，且与DNA来源的细胞类型有密切关系

3.酶切反应的温度

  酶切反应温度也是影响反应的一个很重要的因素。不同的限制性内切酶有不同的最适反应温度，大多数限制性内切酶的最适反应温度为37℃，但也有很多的例外情况，如高于或低于37℃。消化反应的温度高于或低于最适温度都会影响限制性内切酶的活性，甚至使其完全失活。

4.DNA的分子结构

  部分限制性内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需的酶量是消化线性的DNA的许多倍。此外，一些切割位于DNA不同部位限制位点的限制性内切酶，其切割效率也有明显的差异。但一种限制性内切酶对其不同识别位点的切割效率的差异最多不会超过10倍。这样的范围在通常情况下显得无关紧要，但一旦涉及部分酶切消化，则必须考虑。DNA分子中某些特定的限制位点，只有当其他限制位点也同时被广泛切割的条件下，才能被相关的限制性内切酶所消化。少数的一些限制性内切酶，对不同部位的限制位点的切割活性会有很大差异，其中有些位点很难被切割。

5.其他

(1)牛血清白蛋白贮存液和10x反应缓冲液应该在-20℃的温度下保存。不要将牛血清白蛋白直接加入到10x反应缓冲液中再冻存，这样BSA容易产生沉淀。
(2)加人酶之前切记不要通过震荡将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心
(3)对于需要0.5或1个单位的内切酶来说, 过夜反应并不能改善酶切效果，某些情况下还可能对酶切DNA造成不良影响。尤其对切割位点不在识别位点上的内切酶更是如此。 (4)注意千万不要污染反应缓冲液，特别是由质粒DNA、其他限制性内切酶或 DNase造成的污染。此外，还应避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。