抗生素抗性基因主要研究方法总结

1、基于培养方法的耐药微生物的分离鉴定

传统的抗生素耐药性研究方法主要是基于微生物培养，通过抗生素耐药表型来评价其耐药性。细菌药敏试验是最为常用的研究方法，

(1)K-B 琼脂法是目前使用最为广泛的药敏试验，是将浸有抗生素的纸片贴在涂布有细菌的琼脂平板上，抗生素在琼脂平板上呈梯度性扩散，培养后细菌在纸片周围形成一个抑菌圈，最后测定抑菌圈的直径即可评估其药敏性，但是该法不能直接读取细菌的 MIC 值。
(2)肉汤稀释法可测定 MIC 值和最低杀菌浓度，但该法费力，适合少量菌株的药敏测定。
(3)琼脂稀释法可测定细菌的 MIC 值，结果准确可靠，适合做大量菌株的药敏试验。
(4)E-test 法结合了扩散法和稀释法的优点，弥补了 K-B 琼脂法不能测量 MIC 值的缺点， 且操作简便，但是成本高，常用作真菌的药敏试验。

根据所分离微生物的耐药性，利用各种分子生物学方法或者对耐抗生素细菌进行全基因组测序可以获得该菌株抗生素耐药基因的全部信息以及耐药机制。但是环境中可培养微生物仅占环境中微生物总数的0.5%−1.0%，该方法遗漏了大量耐药微生物和耐药基因。

2、基于 PCR 技术的耐药基因的检测

PCR技术可以直接检测微生物或环境样品中的耐药基因，不需要对微生物进行分离培养。由于该方法灵敏、快速、准确，可以在数小时内将目的基因放大到几百万倍，已广泛用于生命科学领域的研究中，是现阶段耐药基因检测的主要手段。但是只能检测到环境中耐药基因的存在与否，很难实现基因的定量分析。

　　

实时荧光定量 PCR通过将荧光基团加入 PCR 反应体系中，借助于荧光信号的积累实时监测 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知的模板进行定量分析。是 PCR 从定性到定量的飞跃，目前已广泛用于耐药基因的定量分析。

　　

但是，无论是普通 PCR 还是 RTQ-PCR 都还局限于已知序列的单一耐药基因检测，不能发现新基因；并且要对大量基因同时检测需要大量的工作，还需要测序分析来进一步确认。

　　

3、基因芯片技术

　　 　　

基因芯片技术是将数以万计、甚至百万计的 DNA 探针固定于固相载体上形成DNA微阵列，将样品核酸用荧光或同位素等方法标记，并通过与芯片探针杂交来检测样本内的多种特定 DNA 序列，通过计算机分析，即可得到样品中大量基因序列特征和基因表达信息。由于基因芯片进行一次杂交即可获得样品中大量序列信息，且具有灵敏、准确、多参数同步分析、高度并行性和快速全自动分析的特点，研究者常将其用于样品中大量耐药基因的检测。目前，通过基因芯片技术对耐药基因的检测可从两方面实现：

　　

一是借助寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点；
二是通过基因表达谱芯片检测药物诱导基因表达的改变。

基因芯片技术可对抗生素使用前后细菌基因的表达水平进行监测，分析不同抗生素作用下的差异基因，从而了解抗生素作用的目标基因、分子机制和特征转录谱。利用基因芯片技术找到耐抗生素细菌的耐药基因，可针对其设计新型抗生素，改善临床上耐药细菌的治疗效果。该技术可以获得环境中耐药基因比较全面的信息。然而，基因芯片技术在实际应用中也存在一些不足之处。

(1)基因芯片需要根据已知的耐药基因序列设计出相应的特异性强的探针，不能发现新的耐药基因类型，且制作复杂、费用昂贵；
(2)该技术本身存在一些问题，如假阳性、假阴性、特异性、芯片质量问题等；
（3）基因芯片数据分析较为复杂，分析前需要进行数据精简和数据标准化，分析结果需要检验和生物学分析。

宏基因组学

宏基因组学 (Metagenomics)是将环境中所有微生物的遗传信息看作一个整体，研究微生物与自然环境或生物体之间关系的一门应用科学。由于环境中微生物多样性极其丰富，99%以上无法在实验室条件下分离培养， 因此宏基因组学的发展跨越了微生物研究的瓶颈， 极大地拓展了微生物学的研究思路和研究方法，是重新认识微生物多样性、从环境中获得新耐药基因的一个重要手段。利用宏基因组学研究耐药基因主要包括以下几个步骤：

 

利用宏基因组文库进行抗生素耐药性功能筛选，可直接为基因耐药表型的筛选提供有利的证据，且可发现新的耐药基因。然而，此方法也存在一定的缺陷：

(1) 该方法存在一定的宿主偏好性和异源表达缺陷。功能筛选依赖于耐药基因在外源宿主中的表达，如果耐药基因在异源宿主中不表达或表达活性低，就很难筛选到相应的耐药基因。
(2) 土壤环境是一个巨大的抗生素耐药基因储存库，其微生物群落具有丰富的遗传多样性，所构建的宏基因组文库只能代表土壤微生物中极小一部分。
(3) 一些耐药基因并不存在于染色体DNA上，而是随着可移动元件在环境中进行水平转移， 如质粒、转座子和整合子等。因此，利用宏基因组文库进行筛选可能会遗失一些耐药基因。
(4) 利用宏基因组文库检测耐药基因，要正确辨别耐药基因的普遍性和高丰度。例如，大肠埃希氏菌中的ampC、铜绿假单胞菌中的 mexAB以及粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)中 aac(6′)-Ii，都属于这些种属微生物的核心基因组，控制其固有的耐药表型。 如果在宏基因组学中检测到这些基因，且在非可移动元件携带的情况下，就只能反映这些微生物的群落大小水平。

高通量测序技术是宏基因组学最为成熟的关键技术，能同时对数百万个DNA分子进行测序， 被广泛应用于基因组学、测全序、表观基因组学以及功能基因组学。通过对环境样品提取总 DNA 测全序，与已知的抗生素耐药基因数据库进行序列比对，从而鉴定耐药基因。然而，此方法的数据分析复杂，并且由于通量的限制，定量性差，不容易检测到丰度较低的微生物。

总之，现代分子生物学技术的发展为分析环境中抗生素耐药性和抗生素耐药基因提供了众多的可能性。多种方法的配合、计算机技术、生物信息技术的融入和应用应该是今后发展的重要方向。

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