抗生素抗性基因检测案例分析

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抗生素抗性基因检测实验操作步骤

本文以客户的案例为背景,介绍了实时荧光定量PCR法检测抗生素抗性基因的所需的试剂耗材以及详细的实验操作步骤。

实验摘要

以目的DNA为模板,PCR扩增获得目的片段,进行TA克隆。提取质粒,单酶切线性化,进行梯度稀释获得一系列不同浓度的标准品。通过实时荧光定量PCR,采用SYBR GREEN染料法,对样品进行绝对定量。

1.试剂与耗材

试剂与耗材
样品:45例土壤样品。 胶回收试剂盒,美国Axygen公司,AP-GX-50。
2×Taq PCR MasterMix,南京钟鼎生物技术有限公司,PC16-1。 SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒,北京艾德莱,DN27。
SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus),Bµlk,宝生物工程(大连)有限公司,RR820L。 Hind III,宝生物工程(大连)有限公司,1060A。
EcoR I,宝生物工程(大连)有限公司,1040A。 pMDTM19-T Vector Cloning Kit,宝生物工程(大连)有限公司,6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit,北京艾德莱生物有限公司,CV1401。 DL2000 DNA Plus Marker(100、250、500、750、1000、1500、2000 bp),南京诺唯赞生物技术有限公司,MD101。
1Kb DNA Ladder Marker(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 kb),南京诺唯赞生物技术有限公司,MD105-01。 GelStain,北京全式金生物技术有限公司,GS101-01。
Agarose,西班牙Biowest公司,91622。 离心管,美国Axygen公司,311-01-051。
枪头,美国Axygen公司。 其它试剂均为国产分析纯。

2.主要实验仪器

主要实验仪器
荧光定量PCR仪,杭州BIOER,Lightcycle K。 基因扩增梯度PCR仪,杭州博日,TC-96/G/H(b)C。
台式高速冷冻离心机,美国BECKMAN公司,Allegra 21R。 电子天平,美国AHOMS公司,AR5120。
恒温水浴锅,美国Amersham Pharmacia公司,MultiTemp III。 紫外透射仪,美国Amersham Pharmacia公司,Hofer MV-25。
雪花状制冰机,日本SANYO公司,SIM-F140AY65。 移液器,德国Eppendorf公司。
单人单面(垂直送风)洁净工作台,苏州苏洁净化设备有限公司,SJ-CJ-1FD。

3.抗性基因检测实验步骤及结果

3.1.DNA提取

提取步骤参见SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒说明书。

3.2.DNA扩增

PCR反应体系如下:

PCR反应体系图

PCR反应体系如下:

PCR反应程序图

3.3.TA克隆

pMDTM19-T Vector Cloning Kit,宝生物工程(大连)有限公司,6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit,北京艾德莱生物有限公司,CV1401。

(1)将上述PCR产物切胶回收后,在PCR管中配制下列溶液:

TA克隆反应体系图

(2)室温(20℃-30℃)连接5 min。

(3)取100 µL感受态细胞,置于室温解冻,完全解冻后轻弹几次将细胞均匀悬浮。

(4)加入连接产物,轻轻混匀,室温放置5min。

(5) 向离心管中加入500 µL不含抗生素的LB培养基,混匀。37℃,200 r/min,30 min。

(6)吸取复苏后细菌,均匀涂在含Amp的琼脂培养基上。37℃,倒置待平板吸收全部菌液,过夜培养。

(7)挑取阳性单菌落,PCR检测,并送样测序。

3.4.标准曲线的制作

(1)将阳性菌株,接种到含氨苄抗性的LB培养基中,37℃ 200 r/min,摇菌过夜。

(2)提取质粒,通过单酶切后,回收酶切产物。

(3)测浓度,计算拷贝数,制成标准品。

3.5.荧光定量PCR

反应体系的配制(总体积20 μL):

荧光定量PCR反应体系图

荧光定量PCR扩增条件的设置:

扩增曲线:94℃ 30 s;94℃ 10 s,60℃ 12 s,72℃ 30 s循环45次,72℃单点检测信号。

溶解曲线:95℃ 0 s,65℃ 15 s,95℃ 0 s,连续检测信号。

3.6.实验结果

抗性基因的相对丰度

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