1.RACE引物设计的原则

(1)首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

(2).引物长度以23-28 nt为宜。

(3).引物中的GC含量一般为50%-70％，GC、AT分布均匀，应尽量避免局部富含GC或AT。

(4).引物最好不形成二级结构（发夹结构等），与5′RACE Outer Primer和5′RACE Inner Primer不能形成复杂结构。

(5).引物3′端的3～4个碱基不要与配对引物形成互补序列。

(6).使用高特异性引物，利用特异性引物增加目的片段的特异性，从而提高目的片段的克隆效率。

(7).推荐使用Primer Premier5 ，使用方便，网上都有教程，查询引物 5`RACE 3`RACE 最后先点 Tm 再点 Rating，选择前面得分搞得， 程序前两步按标准程序走，最后一步就按引物的 Tm 走，一般选预计长度 200 以上的，跑胶比较好看。

2.RACE反应中的一些注意事项

􀂙(1).cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

(2).􀂙RACE-PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

(3).在进行5‘和3’RACE-PCR的时候应该使用热启动。

(4).引物GSP中的GC含量要在50－70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。

(5).如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。

(6).降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

3.提高RACE技术效率的几点建议

(1).选择合适的RACE技术可以有效地扩增所需要的目的片段。对于那些缺乏经验的实验工作者或实验经费限制的实验，最好是查阅相关文献，并且做一些预备实验，从而确定合适的RACE技术。

(2).在RNA提取过程中应注意RNA的完整性，完整的RNA结构会减少非目的片段或者不完整片段的产生。

(3).应用巢氏PCR。巢氏PCR利用两对不同的引物精确地克隆所需的目的片段。应用巢氏PCR设计引物时，在引物中加入特异性序列和适当的酶切位点，一方面可以增加对目的片段的特异性克隆，另一面也方便后续的测序和试验。将巢氏PCR与RACE技术结合可以提高克隆的准确度

(4).选用耐热酶。 在逆转录过程中使用较高的温度，不仅利于RNA二级结构打开和逆转录酶的结合，还可以加快RT-PCR反应速率，有利于RT-PCR反应的进行。但过高的反应温度会降低逆转录酶的活性，因此选用耐热性高的逆转录酶即可以在高温下反应，又能保持高的酶活，保证RACE的质量。

(5).选择适合的加尾碱基。在5‘端加尾需要选择poly A或poly G，poly A在与引物结合的能力比poly G弱，这时候可以从模板中（G+C）%来考虑选用哪种加尾碱基。通常（G+C）%高的时候，选用poly A，而（G+C）%低的时候可以选用poly G。这样一方面可以使退火温度在合适的范围，另一方面可以降低引物非特异性结合的几率

4.关于RACE产物的验证

1.对于RACE产物的验证是有用且必要的，因为你很有可能得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，目前有三种方法：即
(1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
(2)Southern杂交
(3)克隆并测序

2.比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
(1)对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
(2)对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
(3)如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。

3.RACE产物的克隆和测序：
(1)可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。
(2)电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
(3)将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、Ecor1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中