1.试剂和耗材

名称	公司	名称	名称	公司
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Fermentas公司	Pfu DNA聚合酶	Zoonbio
PCR反应管	Fisher公司	Agarose	上海基因公司
DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒	AXYGEN公司	其他试剂均为国产分析纯

2.主要实验仪器

名称	公司	名称	公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机	BECKMAN	台式高速离心机	SORVAL
Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统	BIO-RAD	PTC-200基因扩增仪	MJ Research
320-S pH计	Mettler Toledo	AR5120电子天平	AHOM S
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪	Amersham Pharmacia	雪花状制冰机	SANYO

3.实验方法

3.1.RNA质量检测

琼脂糖凝胶电泳检测客户提供的RNA样本，结果有较完整的28S，18S rRNA，总RNA的完整性较好，可以用于后续实验。

3.2.cDNA第一链的合成

(1)、在无RNA酶的PCR管中加入1ug的总RNA，和1ul的100uM的oligo (dT)引物，并用DEPC处理过的灭菌水加至体积12ul.

(2)、将上述混合液于65℃处理5分钟，然后在冰上立即冷却1分钟。

(3)、然后再在反应液中依次加入4ul 5X reaction buffer、1ul RiboLock RNase Inhibitor (20 u/μl)、2ul 10 mM dNTP mix、1ul RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/μl).

(4)、将其轻轻混匀，并短暂离心。

(5)、在PCR仪上42℃孵育1个小时。

(6)、70℃赋予5分钟结束反应。

3.3.中间片段序列的获取

3.3.1.引物的设计及序列

利用客户提供的近缘物种参考序列，采用clustalx比对软件进行简并引物的设计

3.3.2.PCR反应体系及条件

3.3.3.目的片段的回收纯化

3.3.4.目的片段的克隆及测序

纯化后的PCR产物直接进行测序，结果如下：此处涉及客户隐私，省略

3.3.5、5’RACE实验

3.3.5.1、引物的设计及序列

利用中间片段序列结果，采用Primer Premier 5.0软件设计三条特异性5’RACE引物，进行合成。

  反向PCR是对一个已知序列的DNA片断两侧的未知序列进行扩增和研究的方法。

3.3.5.2、目的基因第一链cDNA的合成

使用SUPERSCRIPT II RT 酶和引物A对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix 对合成的cDNA进行去RNA处理。

（1）按如下体系添加:

（2）70℃温育上述混合物10分钟，并在冰上冷却1分钟。简短离心，按如下体系加入：

终体积为24微升。 (3)温柔混合和离心，42℃温育1分钟。
(4)添加 1 μl of SUPERSCRIPTII RT，42° C温育50分钟。
(5)70℃温育15分钟。
(6)简短离心并在 37° C反应。
(7)添加1 μl of RNase mix，简短混合37° C反应30分钟，简短离心并置于冰上。

3.3.5.3 使用DNA Purification System: GLASSMAX DNA isolation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化。

1.）冷却溶液到室温。
(2)对于每个样本进行纯化，平衡〜100微升灭菌蒸馏水，在65℃下，在步骤9中使用。
(3)添加120μl的粘合溶液（6M碘化钠）进行的第一链的反应。
(4)转移基因/碘化钠溶液至GLASSMAX旋筒。离心机13,000×g 20秒。
(5)溶液转移到一个离心管中。保存溶液，直到cDNA的得到确认。
(6)添加0.4毫升冷的（4℃）1X洗涤缓冲液到旋转筒。13000×g离心20秒。丢弃穿透液。重复此洗涤步骤三次。
(7)用400μl冷的（4℃）70％的乙醇洗涤盒两次如在步骤6中描述。
(8)除去最后70%的乙醇， 13,000×g离心1分钟。
(9)旋筒插入到一个新的样本回收管。加入50μl无菌蒸馏水（预热至65℃）。离心以13,000×g离心20秒以洗脱cDNA。

3.3.5.4 使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C

(1) 温和加入如下体系：

(2)94℃温育2-3分钟，冰上冷却1分钟，置于冰上。
(3)加入1 μl TdT，37° C温育10分钟。
(4)65° C加热十分钟灭活TdT，简短离心置于冰上。

3.3.5.5 使用引物B和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增。

热循环仪设置94°C。
2.) 向 0.2 or 0.5-ml thin-wall PCR tube 中添加如下体系并置于冰上:

进行PCR反应，程序如下：

3.3.5.6 使用引物C和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增

3.3.5.7 目的片段的回收纯化

将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，步骤按回收试剂盒说明书进行，电泳检测结果如下：

3.3.5.8 目的片段的克隆及测序

纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序，结果如下：此处省略

3.3.6. 3’RACE实验

3.3.6.1引物的设计及序列

利用中间片段序列结果，采用Primer Premier 5.0软件设计两条特异性3’RACE引物，进行合成。

3.3.6.2 实验方法及结果

(1)、使用逆转录酶SMARTScribe™ Reverse Transcriptase 和引物3’ CDS primer A 对总RNA进行逆转录合成cDNA.
(2)、使用引物 g 和 UPM ，以上面合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。
(3)、将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物 h 和 UPM进行第二轮PCR扩增。
(4)、将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，电泳结果如下：

(5)、纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接，转化后送至上海生工直接测序，结果如下：此处省略

5. 基因全长拼接及ORF预测结果

根据中间片段序列，5’RACE和3’RACE结果，拼接出实验目的基因的全长cDNA序列，然后通过NCBI比对分析预测出基因的起始和终止密码子位置，用红色字体标出。结果如下：此处省略