实时荧光定量PCR目前已经是生命科学领域的一项常规技术。正如其名，它有着实时、荧光、定量三大特点。相比传统PCR，qPCR不仅能检测扩增产物，还能在整个扩增过程中实时监测产物量的变化，从而实现对起始模板的精确定量。本文系统介绍荧光定量PCR的原理、常用方法以及应用领域，并附上原理示意图。
- 荧光定量PCR原理：荧光阈值、Ct值与数学原理
- 常用方法一：SYBR Green I 法（原理、优缺点）
- 常用方法二：TaqMan 法（原理、探针设计原则、优缺点）
- 荧光定量PCR的三大应用领域
- 常见问题解答（FAQ）
荧光定量PCR原理是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确地对起始模板进行定量分析。
在PCR反应中加入能示踪扩增产物的荧光化学物质，随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化。
这里引入两个概念，即荧光阈值和Ct值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。
荧光定量PCR数学原理
这里要解释的是一个问题，即为什么Ct值与初始模板的量成正比？我们先来看PCR的扩增方程：
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度（RB）加上每个分子的荧光强度（即单位荧光强度，RS）与分子数目的乘积：
如果从标准曲线上得到斜率，就可以算出扩增效率，一般来讲PCR扩增效率在90%-110%之间都是可以用于数据分析的，低于100%是因为PCR反应中存在抑制因素，高于100%可能有一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
核心公式：N = No × (1+e)n。取对数后，Ct值与初始模板浓度的对数呈线性关系，这是qPCR定量的数学基础。扩增效率 E = 10-1/斜率 - 1，理想斜率应在 -3.6 至 -3.1 之间。
原理
SYBR Green I 是一种结合到小沟部位的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，荧光增强。SYBR Green I 染料只有和双链DNA结合后才发荧光，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
优缺点
| 优点 | 缺点 |
|---|---|
| 1. 使用方便——不必设计复杂的荧光探针 2. 没有序列特异性——可以用于不同的模板 3. 便宜 4. 灵敏 |
1. 与非特异性产物结合 |
原理
该法是最早用于定量的方法，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
TaqMan 探针设计原则
长度 30-45bp，Tm 比引物至少高 5℃。
尽量靠近上游引物。
5' 端不要有 G，G 会有淬灭作用，影响定量。
3' 端必须封闭，防止探针在 PCR 中延伸。
优缺点
| 优点 | 缺点 |
|---|---|
| 1. 对目标序列有很高的特异性——特别适合于 SNP 检测 | 1. 价格较高 2. 只适合于一个特定的目标 3. 不能进行融解曲线分析 4. 背景高 |
两种方法的选择：SYBR Green I 法便宜、通用、上手快，适合基因表达初筛和大规模筛选；TaqMan 法特异性好，适合病原体诊断、SNP 分型等需要精准打击的应用。两者不是替代关系，而是互补关系。
这是荧光定量PCR的直接应用，对病毒以及病菌的浓度、转基因的拷贝数、RNAi 基因失活率等进行绝对定量分析。
(1) 对未知 SNP 进行分析：即找寻未知的 SNP 或确定某一未知 SNP 与某遗传病的关系。最有效的方法是对那些含有 SNP 的 DNA 链进行测序，确认突变的位置和碱基类别。
(2) 对已知 SNP 进行分析：也就是基因分型，即对不同群体 SNP 遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。比较成熟的技术有 TaqMan 探针法，尤其适合样品量特别大的情况。
例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差异结果的确证。
应用领域小结：绝对定量分析（病毒/病菌浓度、转基因拷贝数）→ SNP 检测分析（未知 SNP 寻找、已知 SNP 基因分型）→ 基因表达差异分析（不同处理、不同时相的基因表达比较）。三大应用覆盖了从基础研究到临床诊断的主要需求。
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- 荧光定量PCR相对定量的应用领域：基因的表达研究、microRNA 定量分析。
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