荧光定量PCR实验FAQ

1、如何处理QPCR结果？

比较CT法

根据基因表达量的计算公式，基因表达量=2^-△△Ct,其中△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）

例如：

验证基因A的敲低效果，实验分为两组：对照组和实验组。每个样本设置三个复孔，通过PCR仪的检测得到Ct值，先根据公式计算出△△Ct值，再计算出基因的表达量，取对照组的表达量的平均值，让所有的数据除以平均值，这样我们就将对照组基因A的表达量定位100%。最后将整理好的数据，在Graph pad作图即可。

2、如何验证提取的RNA是否合格？

一般使用紫外分光光度法，根据OD260和OD280，以及OD260和OD230的比值来判断。当OD260/OD280在1.8-2.0之间时，说明RNA的纯度合格，可用于后续试验，OD260/OD280＜1.8，说明可能有蛋白质或酚类物质的污染，如在230nm处有吸收峰，说明RNA提取中引入了有机化合物和盐离子的污染，理想状态下OD260/OD230应当在2左右，如有污染比值会小于2。

3、RNA的质量好坏？

可以用电泳法检测RNA的完整性，可以从中看出RNA的质量好坏。跑胶结束后，在紫外灯的照射下，我们可以得到下图，一般来说要有清晰的三条条带，5s,18s和28s rRNA,正常情况下28s最亮，其次是18s,如果28s条带暗于18s和5s，或者条带出现明显的拖尾，甚至整个条带弥散不清，说明RNA已经发生降解。

4、如何判断引物设计是否有问题？

设计QPCR引物时，我们要验证引物是否能有效地扩增目的片段？首先看扩增曲线，如果引物能扩增目的片段，扩增曲线呈S型。如果呈指数增长型，可能是cDNA浓度过低，可适当增加cDNA浓度。再看溶解曲线，溶解曲线应该只有一个峰值，而且峰值的位置是在Tm附近，距离Tm较远，或存在多个峰值则需要重新设计引物。最后，如果怀疑仪器传感器问题，可以将QPCR产物做琼脂电泳，如果引物能扩增片段，会在80-250bp附近出现一个条带。

5、QPCR结果为什么没有差异？

可能是实验操作出现的问题，很多人存在一个误区，认为逆转录时加入体系的RNA总量越多越好，在配逆转录体系时，RNA模板的总量应控制在10pg-1vg之间，或mRNA模板的总量控制在10pg-500ng,超出这个范围反而会导致结果异常。以干扰为例，灰色加红色区域代表mRNA总量，红色区域代表目的基因的mRNA总量,当整个mRNA都被逆转录的时候，干扰的mRNA量就明显会比对照组少很多。但如果RNA的总量过大，逆转录体系只能逆转录这个扇形区域的部分，可能就会出现没有差异的现象，甚至会出现干扰组的mRNA比对照组还要高的假象。

6、为什么在RNA提取时，RNA总量很低？

根据RNA提取的总流程，我们要排除的问题是：
1、在RNA提取中细胞是否裂解充分。加入Trizol到孔板或者平皿后，要用移液器反复的吹打几下，如果不确认是否裂解充分，我们可以把培养板密封好，放置在显微镜下，观察是否还有细胞，正常情况下细胞都脱落、裂解，视野中没有完整的细胞形态。
2、要确保有足够的细胞量。一般12孔板一个孔作为一个样本，如果细胞体积大，就换成6孔板或者平皿。
3、在提取RNA时加入的试剂比例正确，以Trizol为例，1ml的Trizol对应的是200微升的氯仿和500微升的异丙醇，如果要减少Trizol的用量就按照比例减少氯仿和异丙醇的用量。
4、异丙醇加入后会分层，需要轻摇混匀。RNA溶液中异丙醇的浓度上不去是不会出现RNA沉淀的，所以加入异丙醇后要摇匀溶液。
5、RNA出现沉淀后，要用乙醇洗涤沉淀两次，这时沉淀是清晰可见的，我们要用记号笔标记一下沉淀的位置。因为在沉淀晾干后会变得透明，加入DEPC水后很可能溶解不完全。最后，用DEPC水溶解时，最好先加入10微升，溶解后检测一下浓度再稀释，如果RNA太稀就没有办法做后续的实验了。

7、荧光定量PCR实验中无Ct值出现

(1)反应的循环数不够：一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。
(2)检测荧光信号的步骤有误：SYB-Rgreen法（SG法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号，Taman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。
(3)引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。
(4)模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
(5)模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
(6)序列或者引物有误：检测样品中不含有待检测基因。

8、Ct值出现过晚（Ct＞38）

(1)扩增效率低: 优化反应条件；设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应等。
(2)模版降解或模版浓度太高。
(3)试剂灵敏度不好：更换更高灵敏度、抗干扰的试剂。
(4)检测基因结构复杂：高GC、复杂二级结构和长片段模版，都会影响PCR扩增。
(5)扩增产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

9、扩增效率低

（1）引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。
（2）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
（3）反应条件不够优化：可调整退火温度或改为三步扩增法。
（4）反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。 　　

10、溶解曲线不止一个主峰

(1)引物设计不够优化：应避免引物二聚体和非特异性扩增出现。
(2)同源性比较高：被检测基因在待检测样品有同源性较高的序列。
(3)模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

11、标准曲线线性关系不佳

（1）加样/稀释误差: 使得标准品不呈梯度。
（2）标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
（3）引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。
（4）模板中存在抑制物，或模板浓度过高

12、负对照有信号

(1)引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
(2）模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
（3）实验器材污染：移液器、水、枪头或者荧光定量PCR孔内有荧光污染。

13、如何提高实验反应的灵敏度与特异性？

(1)确定模板RNA完整性，无DNA污染。
(2)RNA模板中不应含有扩增反应的抑制剂。
(3)为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。
(4)使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
(5)若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
(6)设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

14、避免RNA降解的方法有哪些？

(1)在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA。
(2)运用良好无污染的技术分离RNA
(3)将组织提取后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。

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