比较CT法

根据基因表达量的计算公式：基因表达量 = 2^-△△Ct，其中 △△Ct = △Ct（实验组）- △Ct（对照组）。

验证基因A的敲低效果，实验分为两组：对照组和实验组。每个样本设置三个复孔，通过PCR仪的检测得到Ct值，先根据公式计算出△△Ct值，再计算出基因的表达量，取对照组的表达量的平均值，让所有的数据除以平均值，这样我们就将对照组基因A的表达量定位100%。最后将整理好的数据，在GraphPad作图即可。

一般使用紫外分光光度法，根据 OD260 和 OD280，以及 OD260 和 OD230 的比值来判断。

• 当 OD260/OD280 在 1.8-2.0 之间时，说明 RNA 的纯度合格，可用于后续试验。
• OD260/OD280 ＜1.8，说明可能有蛋白质或酚类物质的污染。
• 如在 230nm 处有吸收峰，说明 RNA 提取中引入了有机化合物和盐离子的污染。
• 理想状态下 OD260/OD230 应当在 2 左右，如有污染比值会小于 2。

可以用电泳法检测 RNA 的完整性，可以从中看出 RNA 的质量好坏。跑胶结束后，在紫外灯的照射下，一般来说要有清晰的三条条带，5s、18s 和 28s rRNA，正常情况下 28s 最亮，其次是 18s。如果 28s 条带暗于 18s 和 5s，或者条带出现明显的拖尾，甚至整个条带弥散不清，说明 RNA 已经发生降解。

根据 RNA 提取的总流程，我们要排除的问题是：

1. 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA。
2. 运用良好无污染的技术分离 RNA。
3. 将组织提取后立刻提取 RNA，并将提取好的 RNA 反转录为 cDNA 进行低温保存。

设计 QPCR 引物时，我们要验证引物是否能有效地扩增目的片段？

• 看扩增曲线：如果引物能扩增目的片段，扩增曲线呈 S 型。如果呈指数增长型，可能是 cDNA 浓度过低，可适当增加 cDNA 浓度。
• 看溶解曲线：溶解曲线应该只有一个峰值，而且峰值的位置是在 Tm 附近，距离 Tm 较远，或存在多个峰值则需要重新设计引物。
• 琼脂糖电泳验证：如果怀疑仪器传感器问题，可以将 QPCR 产物做琼脂电泳，如果引物能扩增片段，会在 80-250bp 附近出现一个条带。

可能是实验操作出现的问题。很多人存在一个误区，认为逆转录时加入体系的 RNA 总量越多越好，在配逆转录体系时，RNA 模板的总量应控制在 10pg-1μg 之间，或 mRNA 模板的总量控制在 10pg-500ng，超出这个范围反而会导致结果异常。

以干扰为例，灰色加红色区域代表 mRNA 总量，红色区域代表目的基因的 mRNA 总量，当整个 mRNA 都被逆转录的时候，干扰的 mRNA 量就明显会比对照组少很多。但如果 RNA 的总量过大，逆转录体系只能逆转录这个扇形区域的部分，可能就会出现没有差异的现象，甚至会出现干扰组的 mRNA 比对照组还要高的假象。

1. 反应的循环数不够：一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。
2. 检测荧光信号的步骤有误：SYBR Green法（SG法）采用的是 72℃ 延伸时采集荧光信号，TaqMan 法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。
3. 引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。
4. 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
5. 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
6. 序列或者引物有误：检测样品中不含有待检测基因。

1. 扩增效率低：优化反应条件；设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应等。
2. 模板降解或模板浓度太高。
3. 试剂灵敏度不好：更换更高灵敏度、抗干扰的试剂。
4. 检测基因结构复杂：高 GC、复杂二级结构和长片段模板，都会影响 PCR 扩增。
5. 扩增产物太长：一般采用 80-150bp 的产物长度。

1. 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。
2. 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
3. 反应条件不够优化：可调整退火温度或改为三步扩增法。
4. 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

1. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和非特异性扩增出现。
2. 同源性比较高：被检测基因在待检测样品有同源性较高的序列。
3. 模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

1. 加样/稀释误差：使得标准品不呈梯度。
2. 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3. 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。
4. 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

1. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2. 模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
3. 实验器材污染：移液器、水、枪头或者荧光定量 PCR 孔内有荧光污染。

1. 确定模板 RNA 完整性，无 DNA 污染。
2. RNA 模板中不应含有扩增反应的抑制剂。
3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入 RNase 抑制剂 RNasin。
4. 使用适量的模板 RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
6. 设计引物时，避免在引物 3' 端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

根据基因表达量的计算公式，基因表达量=2^-△△Ct，其中△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）。以验证基因A的敲低效果为例，实验分为对照组和实验组，每个样本设置三个复孔。先根据公式计算出△△Ct值，再计算出基因的表达量，取对照组的表达量的平均值，让所有的数据除以平均值，将对照组基因A的表达量定位100%。最后将整理好的数据在GraphPad作图即可。

一般使用紫外分光光度法，根据OD260和OD280，以及OD260和OD230的比值来判断。当OD260/OD280在1.8-2.0之间时，说明RNA的纯度合格，可用于后续试验；OD260/OD280＜1.8，说明可能有蛋白质或酚类物质的污染；如在230nm处有吸收峰，说明RNA提取中引入了有机化合物和盐离子的污染。理想状态下OD260/OD230应当在2左右，如有污染比值会小于2。

可以用电泳法检测RNA的完整性。跑胶结束后，在紫外灯的照射下，一般来说要有清晰的三条条带，5s、18s和28s rRNA，正常情况下28s最亮，其次是18s。如果28s条带暗于18s和5s，或者条带出现明显的拖尾，甚至整个条带弥散不清，说明RNA已经发生降解。

设计QPCR引物时，要验证引物是否能有效扩增目的片段。首先看扩增曲线，如果引物能扩增目的片段，扩增曲线呈S型。如果呈指数增长型，可能是cDNA浓度过低，可适当增加cDNA浓度。再看溶解曲线，溶解曲线应该只有一个峰值，而且峰值的位置是在Tm附近，距离Tm较远，或存在多个峰值则需要重新设计引物。最后，如果怀疑仪器传感器问题，可以将QPCR产物做琼脂电泳，如果引物能扩增片段，会在80-250bp附近出现一个条带。

可能是实验操作出现的问题。很多人存在一个误区，认为逆转录时加入体系的RNA总量越多越好。在配逆转录体系时，RNA模板的总量应控制在10pg-1μg之间，或mRNA模板的总量控制在10pg-500ng，超出这个范围反而会导致结果异常。以干扰为例，当整个mRNA都被逆转录的时候，干扰的mRNA量就明显会比对照组少很多。但如果RNA的总量过大，逆转录体系只能逆转录这个扇形区域的部分，可能就会出现没有差异的现象，甚至会出现干扰组的mRNA比对照组还要高的假象。

根据RNA提取的总流程，需要排除以下问题：①在RNA提取中细胞是否裂解充分，加入Trizol后要用移液器反复吹打，可把培养板密封好放置在显微镜下观察是否还有完整细胞；②要确保有足够的细胞量，一般12孔板一个孔作为一个样本，如果细胞体积大，就换成6孔板或者平皿；③提取RNA时加入的试剂比例正确，以Trizol为例，1ml的Trizol对应的是200微升的氯仿和500微升的异丙醇；④异丙醇加入后需要轻摇混匀，RNA溶液中异丙醇的浓度上不去是不会出现RNA沉淀的；⑤RNA出现沉淀后，要用乙醇洗涤沉淀两次，用记号笔标记沉淀位置，用DEPC水溶解时最好先加入10微升，溶解后检测浓度再稀释。

常见原因包括：①反应的循环数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值；②检测荧光信号的步骤有误，SYBR Green法采用的是72℃延伸时采集荧光信号，TaqMan法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集；③引物或探针降解，可通过PAGE电泳检测其完整性；④模板量不足，对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；⑤模板降解，避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；⑥序列或者引物有误，检测样品中不含有待检测基因。

常见原因包括：①扩增效率低，可优化反应条件、设计更好的引物或探针、改用三步法进行反应等；②模板降解或模板浓度太高；③试剂灵敏度不好，更换更高灵敏度、抗干扰的试剂；④检测基因结构复杂，高GC、复杂二级结构和长片段模板都会影响PCR扩增；⑤扩增产物太长，一般采用80-150bp的产物长度。

①引物或探针不佳，重新设计更好的引物和探针；②反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；③反应条件不够优化，可调整退火温度或改为三步扩增法；④反应体系中有PCR反应抑制物，一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

①引物设计不够优化，应避免引物二聚体和非特异性扩增出现；②同源性比较高，被检测基因在待检测样品有同源性较高的序列；③模板有基因组的污染，RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

①加样/稀释误差，使得标准品不呈梯度；②标准品出现降解，应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；③引物或探针不佳，重新设计更好的引物和探针；④模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

①引物设计不够优化，应避免引物二聚体和发夹结构的出现；②模板有基因组的污染，RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增；③实验器材污染，移液器、水、枪头或者荧光定量PCR孔内有荧光污染。

①确定模板RNA完整性，无DNA污染；②RNA模板中不应含有扩增反应的抑制剂；③为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin；④使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱；⑤若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；⑥设计引物时，避免在引物3'端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；②运用良好无污染的技术分离RNA；③将组织提取后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。