抗体重组表达纯化服务案例

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抗体重组表达纯化服务实验报告案例

本案例基于pAZ-V5+293T分泌表达体系,使用基因合成的方法合成重链和轻链的可变区,分别将可变区通过重组克隆的方式构建至pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ表达载体,通过双质粒瞬时转染HEK293悬浮细胞,经过通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况,经过表达验证后,扩大培养收集细胞上清并通过protien A亲和柱的亲和纯化获得目的蛋白。本案例所涉及数据及实验方法结论,未经钟鼎生物授权,任何单位及个人不得转载或盗用,违者必究!

一、实验设计 
我们分析客户提供的重轻链理论序列,符合理论分子量大小,抗体蛋白也无跨膜等特殊结构,因此我们设计思路为:
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板,通过密码子优化一套最适宜HEK293T细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ载体来进行实验,利用载体自带的V53信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外,重轻链蛋白在细胞上清中形成二硫键,组装成四聚体结构。
  依据上述设计思路,以基因合成的方式构建pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ质粒,经过测序和酶切验证无误后,提取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293T细胞,通过western blot检测蛋白表达情况,确认蛋白表达情况,再通过Protein A亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材
DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂等购自Invitrogen(Gibco)无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂等(购自Sigma公司)、抽提试剂盒(购自Axygen公司)、PCR试剂盒(IO-RAD公司) 、六孔板(购自corning公司)、细胞培养瓶(购自corning公司)、离心管(购自corning公司)、PCR反应管(购自Fisher公司)、Agarose(购自上海基因公司)、DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自AXYGEN公司)、低熔点琼脂糖(购自sigma公司)、中性红(购自碧云天生物公司)、其它试剂均为国产分析纯。

三、主要实验仪器
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 (美国BECKMAN公司),台式高速离心机(德国SORVAL公司),Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统(美国BIO-RAD公司),PTC-200基因扩增仪(美国MJ Research公司)
320-S pH计(美国Mettler Toledo公司),AR5120电子天平(美国AHOM S公司),MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪(美国Amersham Pharmacia公司),雪花状制冰机(日本SANYO公司),JY92-2D超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所),蛋白核酸检测仪(南京大学普阳科学仪器厂),超净工作台(中国苏净集团),NANODROP2000(美国Thermo公司)

四、蛋白性质分析
4.1 抗体重轻链可变区序列获得(抗体测序项目请参考单独的实验案例文件)
  针对基因序列分析稀有密码子情况,分析可变区蛋白序列的跨膜结构和亲疏水性,从而决定载体设计的实验方案,由于篇幅限制,此处不做详细的累述。我们专业的客服会依据您提供的信息免费分析并设计实验方案。

稀有密码子分析 蛋白亲疏水性结构分析 蛋白信号肽结构分析

五、实验方法及实验结果
5.1 pAZ-V5-hCH-IgG1表达质粒构建(pAZ-V5-hCL-IgGκ流程相似,此处略)
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成重链可变区基因,重组克隆连接至pAZ-V5-hCH-IgG1载体的;将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果拼接如下所示(序列略),载体结构如下;

载体结构图

5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下:

测序峰图

测序拼接序列与理论序列相比对,结果显示获得序列与理论序列100%匹配,比对文件截图如下所示:

测序峰图

5.3 pAZ-V5-hCH-IgG1质粒酶切图与载体构建示意图如下所示:

pAZ-V5-hCH-IgG1质粒酶切图与载体构建示意图

5.4.1. 无内毒素质粒抽提
使用Sigma公司Endotoxin Free质粒重量抽提试剂盒抽提p表达质粒,经LAL法测定<0.1EU/ug。
5.4.2. 待转染细胞预处理
转染前一天,将形态良好、生长旺盛处于对数生长期的HEK93T细胞用胰蛋白酶消化后稀释至4×105/mL的密度,接入24孔细胞培养板,轻微振荡使细胞均匀铺在细胞板孔内,每孔500ul,用DMEM高糖培养基培养和传代细胞。平放在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,待细胞长至80-90%汇合度时,可以开始转染操作。
5.4.3 细胞转染
取0.8ug质粒,加入50ul Optipro SFM,混匀后加入2ul 转染试剂,再次混匀后室温孵育20min。将DNA-转染试剂复合物滴加至24孔板中,轻轻混匀,37℃培养箱培养48h。
5.4.4 Western Blot检测培养上清(客户提供待测抗原)
样品上样0.01ug,上样完毕后,聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶,再将电压升至200V直到电泳结束。电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒压100V转膜,约为1.5小时。取下膜后先用PBS洗涤4次,每次5分钟。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1小时。用封闭液稀释一抗,膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。 洗膜4次,每次5 分钟;用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时,洗膜ECL显影。
5.5.1待转染细胞准备
将处于对数生长期的293T细胞用Trypsin消化后稀释至4×105/mL的密度,种于2L的滚瓶中。每个滚瓶加200ml DMEM高糖培养基(含3%胎牛血清),调节滚瓶转速至20转/小时,使细胞均匀贴到转瓶表面,约24小时左右,当细胞贴壁面汇合至90%时进行转染。
5.5.2 DNA预处理
取100ug无内毒素质粒,加入13ml OptiSFM,混匀后加入250ul 转染试剂,再次混匀后室温孵育20min。 5.5.3 细胞转染与表达
将DNA-转染试剂复合物滴加至滚瓶中,轻轻混匀,调节滚瓶转速20转/小时 ,37℃培养箱培养10个小时后换3% 血清的 DMEM中糖500ml,调节滚瓶转速40转/小时。表达4天后收取上清。
5.5.4 重组抗体纯化
准备ProteinA纯化柱,用5-10倍柱体积的PBS平衡柱子。细胞上清以1ml/min的速度上样至ProteinA柱。用20 mM PB缓冲液以0.5 ml/min流速洗脱杂样,至流出液OD280值到达基线。洗脱在蛋白值至核酸蛋白检测仪数值稳定不变时准备洗脱。用Elution-Buffer(0.1M Nacl, 0.1M 甘氨酸, pH 3.0) 以1 ml/min流速洗脱目的抗体,收集流出液,并用PH9.0 Tris- HCL使其pH值恢复至中性,将收集的抗体溶液加入透析袋中,用20 mMPBS(PH7.4)透析过夜,透析后的样品进行SDS-PAGE纯度分析和BCA浓度检测。

纯化后抗体电泳检测结果

纯化后抗体电泳检测结果
(reduced)SDS-PAGE

Lane M: Marker
Lane 1-4 为收集不同洗脱浓度的重组抗体溶液

纯化后抗体电泳检测结果

纯化后抗体电泳检测结果
(non-reduced)SDS-PAGE

Lane M: Marker
Lane 1-3 为收集不同洗脱浓度的重组抗体溶液