一、MST检测的原理是什么？

上图是仪器构造的示意图，毛细管中载有样品和梯度稀释的配体，他们其中一个标记有可以检测的荧光。然后通过红外激光，对毛细管上特别小的点进行加热，大概会比周边的温度高2℃左右。这个温差会产生热泳动的驱动力，分子就会发生热泳动的现象，并泳动出观察区域导致荧光值的降低（见下图）。随着配体和靶标的结合，热泳动的情况也不一样，然后检测器会检测荧光值的变化，并拟合出结合曲线得到Kd值。

二、红外激光加热的温度为什么只比室温高两三度，这样的效果好吗？

和室温相比，两三度的差异确实很小，但是激光加热的点很小，只有几微米，所以能量密度是很大的，驱动力也很强，足够让分子发生一个可观察到的热泳动现象，再配合灵敏的检测器，就能检测到热泳动的现象。

三、配体结合荧光分子后会对荧光值有影响吗，有的话怎么办？

配体分子和荧光分子结合后，大多数情况，不让其热泳动的情况下，他的荧光值都是完全一样的。但在少数情况下，比如说结合之后，分子会发生变化，可能影响到了分子的发光性质，这时可以直接用荧光的变化来进行数据拟合，所以我们采用另外的拟合模式。当然，绝大多数情况是，即使结合之后，初始荧光都是一样的，热泳动之后才会有荧光值的变化。

四、配体要是有荧光怎么办？

MST实验只要有一个分子带有荧光标记就可以，如果配体有可检测的自发荧光，那实验设计中还免去了荧光标记的环节，可以直接用配体做荧光分子。

五、染料会对蛋白本身的活性有影响没？

比如用标记赖氨酸的染料，在标记的时候是控制了标记的时间和浓度的，尽量控制每个蛋白只标记一个荧光分子。因为蛋白上不止一个赖氨酸，所以这是一个随机标记的过程。如果有一部分蛋白因标记而失活，但是一个蛋白只要有一个赖氨酸被标记能产生信号就可以了。如果真的担心荧光标记会对蛋白有影响的时候，就换一种标记的策略，将需要实验的配体进行标记也是可以的。

六、做一次实验的蛋白量和浓度大概是多少？

MST的探测器最低是能探测1nM的荧光分子，比如用His标签，200nM，100uL的至少可以做两个相互作用。如果是用化学反应的方式，比如赖氨酸或者是半胱氨酸标记的，初始提供的蛋白浓度就要高一点，比如2-10uM，100uL。标记出来这是母液，稀释后才能用，工作液的荧光蛋白的浓度控制在10-100nM之间。一个梯度稀释只要10uL稀释后的标记蛋白就够了，所以总共准备200uL就够了，因为最多也就做16个梯度。配体只需要准备20uL最高的浓度的就够了，然后做梯度稀释。

七、MST实验对Buffer有没有限制？

MST实验不像ITC，配体和蛋白的Buffer必须一样，因为我们的样品是后期预混好的，所以我们原来的Buffer可以完全不一样，但是混好后，每个梯度的Buffer就一样了。所以这就避免了像ITC那样为了维持buffer的完全一样，必须得做透析。

八、MST的Kd曲线和ITC的图形很相似，曲线代表的意义是一样的吗？

我们得到的图和ITC的曲线确实很像，物理意义是不一样，但是获得的Kd值都是一样的，数据对比可参见上图，几种技术得到的Kd值差异不大。

九、SPR需要对照来校正本底信号，MST需要同样的操作来去除本底信号吗？

SPR需要对照的通路，因为buffer流过芯片也会有信号， 所以需要扣减本底。对于MST，没有样品就没有荧光，没有背景的。而且SPR也需要做浓度梯度，每个梯度下都需要用纯粹的buffer做扣减。

十、MST能做供价结合吗？

共价结合是一种化学反应，没有亲和力的概念，可以理解为亲和力是无穷大。共价结合只有“有或无”的概念，没有强弱的概念。

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