摘要
1.蛋白标记试剂
2. Ligand Buffer:TNT Buffer ( 10 mmol/L Tris-HCl;150 mol/L NaCl;0.05% Tween 20;pH6.6-7.0)
3.Assay buffer:PBST Buffer(137mM NaCl;2.68mM KCL;8.1mM Na2HPO4;1.76mM KH2PO4;0.05% Tween 20;Ph7.2-7.4)
4. 20% Tween-20
5. MST NT115标准毛细管
仪器名称 | 厂家 |
---|---|
超净工作台 | 苏州净化设备有限公司 |
MST微量热泳动仪 | 德国NanoTemper |
恒温培养箱 | 上海新苗医疗器械制造有限公司 |
离心机 | 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 |
在标准的标记型MST实验中,最多可以一次测量16个稀释梯度。荧光标记的分子(Target)的浓度保持在10-150 nM不变,而另外一个分子(ligand)做2倍梯度稀释。
3.1 Target Protein 蛋白标记:
取Target Protein 蛋白溶液使用Assay Buffer稀释后使用90 µL进行标记,最后得到约160 µL的含有标记蛋白溶液。
3.2 配体分子稀释装载
10 µl梯度稀释的非标记分子(Ligand)和10 µl固定浓度的标记分子(Target)混合后静置反应5min,混合的样品装载到玻璃毛细管中,然后通过MST-NT.115设备进行分析。
3.3 Pretest
实验开始前,进行Pretest步骤,检测Target蛋白标记效率,检测蛋白的吸附及聚集现象。首先用Assay Buffer(添加0.05%的Tweee-20)稀释Target蛋白(Target蛋白工作浓度为20nM-150nM),稀释后取15 µl和15 µl纯Assay Buffer混合,然后用毛细管吸取后置于NT115检测。
3.4 Binding Check
Pretest确认好仪器数值及Target浓度后,开始进行Binding Check步骤。使用Assay Buffer稀释Target蛋白,总60 µl左右。若小分子为水溶液,则直接取小分子原液25 µl和稀释后的蛋白溶液混合,另取25 µl Assay Buffer 和25ul稀释蛋白液混合,若小分子融于DMSO,则需保证蛋白小分子混合溶液中的DMSO含量不高于5%。 用毛细管各吸取4管后置于仪器开始Binding Check。
确认Target分子与Ligand分子有无结合,质控指标为信噪比(SIGNAL-NOISE RATIO)大于5。
3.5 Binding Affinity
完成Binding Check后,如果蛋白无吸附聚集现象,且信噪比达标,则开始进行Binding Affinity。
若小分子融于水溶液中,则直接将小分子母液进行2倍浓度梯度稀释16次,稀释后每管溶液为10 µl,然后加入10 µl 稀释后的蛋白溶液混匀,用毛细管吸取后置于仪器检测。稀释完成后,每管溶液中加入10ul稀释后的蛋白溶液,用移液枪轻轻吹打数次混匀,然后用毛细管吸取后置于仪器分析。
Binding Affinity结果:
Ligand 小分子高浓度不溶,调试最大250 µM,5%DMSO才可溶
Ligand Concentration: 125 µM to 0.00381 µM
Kd: 4.6269E-05
Kd Confidence: ± 8.7577E-06
Signal to Noise: 35.665088
归一化处理:
MST一般认为,软件可自动拟合曲线且信噪比>5的情况下数据可信。
本实验Target Protein与Ligand能够结合。
随小分子浓度增加,结合使a蛋白的泳动速率变快,拟合曲线呈倒”S”型,浓度区间内可获得稳定的上平台,证明两者存在特异性结合,亲和力为46.3 µM,在蛋白与小分子体外分子互作中属于中等结合强度。
KD值表示Ligand分子结合50% Target分子时,Ligand分子的浓度,单位为M。
KD值越大,说明亲和力越低,反之KD值越小,说明Target分子和Ligand分子亲和力越高。
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