在标准的标记型MST实验中，最多可以一次测量16个稀释梯度。荧光标记的分子（Target）的浓度保持在10-150 nM不变，而另外一个分子（ligand）做2倍梯度稀释。

3.1 Target Protein 蛋白标记:

按照Monolith RED-NHS二代蛋白标记试剂盒 protocol进行操作，取Target Protein 蛋白溶液 90 µL进行标记，最后得到约450 µL的含有标记蛋白溶液（浓度为0.1 µM）。

3.2 配体分子稀释装载

10 µl梯度稀释的非标记分子（Ligand）和10 µl固定浓度的标记分子（Target）混合后静置反应5min，混合的样品装载到玻璃毛细管中，然后通过MST-NT.115设备进行分析。

3.3 Pretest

实验开始前，进行Pretest步骤，检测Target蛋白标记效率，检测蛋白的吸附及聚集现象。首先用Assay Buffer(添加0.05%的Tweee-20)稀释Target蛋白（Target蛋白工作浓度为20nM-150nM），稀释后取15 µl和15 µl纯Assay Buffer混合，然后用毛细管吸取后置于NT115检测。

3.4 Binding Check

Pretest确认好仪器数值及Target浓度后，开始进行Binding Check步骤。使用Assay Buffer稀释Target蛋白，总60 µl左右。若小分子为水溶液，则直接取小分子原液25 µl和稀释后的蛋白溶液混合，另取25 µl Assay Buffer 和25ul稀释蛋白液混合，若小分子融于DMSO，则需保证蛋白小分子混合溶液中的DMSO含量不高于5%。 用毛细管各吸取4管后置于仪器开始Binding Check。
确认Target分子与Ligand分子有无结合，质控指标为信噪比（SIGNAL-NOISE RATIO）大于5。

3.5 Binding Affinity

完成Binding Check后，如果蛋白无吸附聚集现象，且信噪比达标，则开始进行Binding Affinity。
若小分子融于水溶液中，则直接将小分子母液进行2倍浓度梯度稀释16次，稀释后每管溶液为10 µl，然后加入10 µl 稀释后的蛋白溶液混匀，用毛细管吸取后置于仪器检测。稀释完成后，每管溶液中加入10ul稀释后的蛋白溶液，用移液枪轻轻吹打数次混匀，然后用毛细管吸取后置于仪器分析。

Binding Affinity结果：

归一化处理：

MST一般认为，软件可自动拟合曲线且信噪比>5的情况下数据可信。
本实验Target Protein与Ligand IAA能够结合，与Ligand NAA无结合。
蛋白泳动速率随IAA浓度变高而变快，拟合曲线呈倒“S”形，下平台期明显，表现为特异性结合，亲和力为0.128μM，在蛋白与小分子体外分子互作中属于中等偏强结合强度。
KD值表示Ligand分子结合50% Target分子时，Ligand分子的浓度，单位为M。
KD值越大，说明亲和力越低，反之KD值越小，说明Target分子和Ligand分子亲和力越高。