实验原理：利用真核生物mRNA的3'端有poly的特征，可以通过与polyA互补的oligo dT 作为引物，在反转录酶的作用，合成cDNA。

实验目的：检测基因的表达模式，以及确定基因的转录方式，扩增基因cDNA，构建cDNA文库及酵母双（单）杂交文库。

试剂与仪器

DEPC (diethyl pyrocarbonate,sigma,CAS:1609-47-8)

ddH20 (DEPC treated and steriled)

DNase I (Amplification Grade, Invitrogen, CAS:18068-015)

oligo d(T)15 (Promega CAS:C1101)

SS Il1 DOUBLE STRANDED CDNA SYTH KIT (Invitrogen, 1015969)

水浴锅、离心机、PCR 仪等。

0.6mL 及 1.5mL tubes ( AXYGEN)

20ul.200ul k 1mL tips(AXYGEN)

操作步骤:

1.取5 μg总RNA至新的不含RNase的0.5或者1.5 ml离心管中，加入1μl DNase I, 1μl 10x缓冲液，加DEPC处理过的水至总体积10μl,混匀后短暂离心，25°C (室温)孵育15分钟。

2.加入1μl 0.5M EDTA,混匀后短暂离心， 65°C水浴10分钟灭活DNase l。

3.加入1μl oligo d(T)15, dNTP 1μl, 65°C水浴10分钟,然后立即置冰上3分钟，短暂离心。

4.加入5X First strand buffer 4μl, DTT 1μl,反转录酶SSII 1μl, RRI 1μl混匀后短暂离心，于50°C水浴反应2小时。

5.75°C水浴灭活15分钟。

6.按每μg起始RNA量终体积20-30μl加水稀释反转录得到的cDNA。

7.检测反转录效果可用ACTIN-M引物做PCR扩增，判断有无基因组污染及浓度。

注意事项:

1.反转录前应确定RNA浓度及质量。

2.在使用前应注意酶单位及反应条件，此实验所用酶可用其它公司产品代替，但单位及反应条件可能不同。

3.步骤3防止复性，RNA易产生高级结构，影响反转录效果。

4.反转录产物为单链cDNA,稳定性不好，-20°C 保存，减少反复冻融次数。

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