mRNA的分离与纯化是研究细胞转录水平与cDNA文库构建的重要步骤，mRNA的质量直接影响cDNA的合成效率。接下来我们就介绍一下mRNA的分离与纯化，包括实验步骤、注意事项与时间安排，供大家参考。

1.实验步骤

1.1.装柱与平衡柱子

(1)取 Oligo(dT)-纤维素 0.5 g，加入1 mL 0.1 mol/L 的 NaOH 重悬。
(2)把Oligo(dT)-纤维素悬浮液灌注到DEPC处理过的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5~1.0 mL，然后加入10 mL DEPC水洗涤柱子。
(3)用10 ~20mL无菌的层析柱加样缓冲液洗涤平衡柱子，直到流出液的pH值为7.5(可采用pH试纸检测）。

1.2.柱上吸附poly(A+) RNA

(1)将提取的总RNA溶液于65℃温育5min后迅速冷却至室温。加热RNA的目的是破坏可能包括poly(A+)的次级结构区域，有利于其吸附。
(2)在总RNA溶液中加入等体积的层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集流出液。当所有的RNA溶液均进入柱床后，加1倍体积的层析柱加样缓冲液，继续收集流出液。
(3)当所有的液体流出柱子后，65 ℃温育5 min后迅速冷却至室温，重新加到柱子中，再次收集流出液。
(4)用5~10倍柱床体积的层析柱加样缓冲液洗柱，每管lmL分管收集，OD₂₆₀测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD₂₆₀值很高，其内含物为无poly(A+)的RNA。后部分收集管中流出液的OD₂₆₀值很低或无吸收。

1.3.从柱中洗脱poly(A+)RNA

(1)用2~3倍柱容积的洗脱缓冲液从Oligo(dT)-纤维素洗脱poly(A+)RNA，分管收集，每部分为1/3~1/2柱体积的流出液。
(2)OD₂₆₀测定poly(A+) RNA分布，合并含poly(A+)RNA的收集管。
(3)加入1/10体积3mol/L的NaAc (pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20 ℃放置 1 h。
(4)4℃，12000rpm离心15 min,小心弃去上清。用70%乙醇洗涤沉淀。此时poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。 (5)4℃，12000rpm离心5min,弃上清，室温晾干。
(6)加入25L DEPC水溶解RNA或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃。mRNA在70%乙醇中-70℃下可保存一年以上。

1.4.从柱中洗脱poly(A+)RNA

(1)用2~3倍柱容积的洗脱缓冲液从Oligo(dT)-纤维素洗脱poly(A+)RNA，分管收集，每部分为1/3~1/2柱体积的流出液。
(2)OD₂₆₀测定poly(A+) RNA分布，合并含poly(A+)RNA的收集管。
(3)加入1/10体积3mol/L的NaAc (pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20 ℃放置 1 h。
(4)4℃，12000rpm离心15 min,小心弃去上清。用70%乙醇洗涤沉淀。此时poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。 (5)4℃，12000rpm离心5min,弃上清，室温晾干。
(6)加入25L DEPC水溶解RNA或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃。mRNA在70%乙醇中-70℃下可保存一年以上。

1.4.Oligo(dT)-纤维素再生

Oligo(dT)-纤维素柱用后可用0.3mol/L的NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN₃）冰箱保存，重复使用。每次用前需用0.1mol/L的NaOH和柱层析加样缓冲液依次淋洗柱床。

2.材料与试剂

2.1.试剂

层析柱加样缓冲液（20mmol/L 的 Tris·Cl, pH7.6; O.5mol/L 的 NaCl; O.1%SDS; 1 mmol/L 的 EDTA，pH 8.0),层析柱洗脱液（10mmol/L 的 Tris·Cl，pH7.6; 0.05% SDS; 1 mmol/L的EDTA，pH8.0),5 mol/L的 NaOH，5 mol/L 的 NaCl，3 mol/L 的 NaAc (pH5.2)，无水乙醇，DEPC水，Oligo (dT)-纤维素。

(2)悬浮培养细胞：细胞量为107,可直接转移到15 mL离心管，500 rpm离心5 min 后；用预冷无菌PBS洗涤1次，弃上清，再加入1mL单相裂解液悬浮细胞沉淀，可用枪头吹打混匀，使细胞裂解完全，最后转移到1.5 mL离心管。

(3)组织样品：解剖所要的组织后，先将这些组织切成小块（100 mg),然后将组织放入盛有液氮的研钵中，用研棒磨碎组织，使组织成粉末状。在研磨过程中要不断添加液氮使组织保持冷冻状态，最后加入1mL单相裂解液裂解组织细胞，再转移到1.5 mL离心管。

2.1.仪器设备

冷冻台式离心机，电热恒温水槽，紫外分光光度计。

3.注意事项

同样在分离纯化mRNA时关键的一点是要防止RNA酶的污染，所有的试剂都必须不含有RNA酶。另外一个关键的因素是，柱子的体积必须与RNA的量相匹配。柱子体积为1mL的Oligo (dT)-纤维素最大量为10mg总RNA,如果总RNA的量较少，则应减少 Oligo (dT)-纤维素的使用量，以防止poly(A+) RNA在过柱以及后续步骤中损失。

4.时间安排

  装柱和平衡柱子大概需要1小时时间，柱上吸附和洗脱以及后面的溶解poly(A+)RNA，需要2个多小时时间。

5.预期结果

大概能够分离纯化总RNA中的1%mRNA。在琼脂糖凝胶电泳mRNA，出现涂抹状条带，范围介于5-10kb之间，而且没有rRNA条带。

与rRNA和tRNA不同的是，真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5'端帽子结构（m7G)和3'端的poly(A+). mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT)-纤维素柱层析法最为有效，能从大量的细胞RNA中分离mRNA，已成为常规方法。在构建cDNA文库时，必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。进行Northern杂交或S1核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A+)RNA能获得更为满意的结果。

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