motif文库常见问题解析

1、Motif文库筛选原理是什么？

Motif文库是基于酵母单杂的实验原理逆向开发的一种实验策略。 首先简单介绍酵母单杂交的原理：利用启动子中DNA序列能够特异性结合转录因子蛋白（TF）的这一特性。以DNA序列为诱饵，从酵母文库中筛选猎物蛋白（TF），只有当TF与DNA序列特异性结合，启动下游报告基因。

Motif文库的工作原理是诱饵与猎物角色互换，以转录因子蛋白（TF）为诱饵，只有当TF与Motif文库中特定DNA序列相结合时，启动下游报告基因，从而得到与TF结合的Motif序列。

2、可以直接用Motif文库筛选来替代Chip-seq， Dap-seq，Cut&tag实验么？

Motif文库筛选的实验策略如下所示：

转录因子蛋白诱饵+Motif库——》 8碱基DNA序列 ——》 调控蛋白

可以寻找到与转录因子蛋白（TF）结合的的motif序列，通过生信比对，从而明确下游可能调控的基因的。从这个维度上说，确实可以部分替代上述实验手段，但是如果作为唯一筛选的依据，证据略显单薄。此外，依据经验还存在如下隐忧:

A、转录因子通过与基因组的调控区域结合影响下游基因的表达水平是一个复杂的生物学过程，效应因子协同、离子环境变化、转录因子蛋白本身的修饰水平变化都参与其中，而单杂作为体外实验，酵母细胞中的转录因子与DNA结合，不能真实映射待研究宿主体内的结合状况，因此所获得的结合数据需要进一步验证。

B、转录因子结合的DNA序列确实是保守基序，但是这个保守基序其实是一组数学的概率集合，而非唯一的序列，因此会存在大量的非特异性结合，导致下游验证工作极其繁重。

C、转录因子与DNA序列的结合与调控不是同义词，不能等同论处，直接通过8个碱基的结合得到调控的结论是不恰当的。

D、Chip-seq DAP-seq和Cut&tag的结合的启动子区域DNA片段，通过测序peak确认的长度约为300bp左右，能够明确的指向特定的下游靶基因。而通过Motif库筛，8个碱基指向的下游靶基因数量太多。

综上述，不推荐Motif文库筛选的方案来替代传统的研究转录因子调控实验手段，但是其对motif序列的精准定位，是非常有价值的数据补充和佐证。

3、motif文库筛选实验方法靠谱吗？

这个世界上没有绝对靠谱的实验方法，从原理上来说，motif文库的实验理论依据是成立的，也有发表的文章来支撑这种实验策略。但是我们从上述的问题回答中，您可以发现，我们一直在强调这个方法学本身的缺陷，只要我们将获得数据应用到适当的场景，例如作为chip-seq的数据补充，这就是比较靠谱的。

4、文库中会包含所有的 motif序列吗？

从理论上来说，1ug的pHis2-Motif(8N) 含有的拷贝数为 1X 10¹⁰，远远大于8碱基的理论库容，但是考虑到某些序列的特殊性，例如重复结构，回文结构等，转化过程中的转化率问题，一定会有一些序列在筛选的过程中丢失。这些丢失数据极小概率事件，几乎可以忽略不计，因此可以认为文库中包含了所有的motif序列。

5、为什么选8N文库，有没有6N,7N,9N,10N等各种长度的文库呢？

从技术手段上来说，我们可以构建各种长度的Motif文库。保守的motif基序，一般是6~8碱基。

基序太短，特异性变差，我们无法获得有用的motif信息。而基序增加，看起来好处更多，但motif每增加一个N，库容量增加4倍，虽然库容只增加了4倍，为了确保检测体系能够兼容库容量的增加，不会发生motif单元序列大量丢失的状况，检测体系的容量并不是按照4倍来增加的，一般是按照3个数量级增加。也就是说，每增加一个N，检测体系的能力需要增加64倍以上，常规实验室酵母转化体系的库容上限为10⁸，因此我们不推荐更大的库容。

6、Motif文库是否需要做自激活测试？

在单杂实验中，作为诱饵序列的启动子DNA系列，插入到诱饵质粒pHis2或pAbAi载体后，必须要进行自激活的测试，才能用于下游筛库工作。而在Motif文库体系中，插入的motif序列只有8碱基，基本没有自激活现象。而motif文库筛选的原理是将诱饵质粒与猎物质粒进行互换进行逆向筛选，因此我们的自激活检测针对单一的猎物质粒进行。最终的筛选压力由猎物质粒的抑制浓度来决定。

7、从哪里能获得这个motif文库？

目前市面上提供分子生物的技术服务公司都可以构建这个文库。

当然，钟鼎生物已经构建了8N-motif文库，其实您大可不必再耗费人力物力来重复构建。我们可以“免费”提供给您使用。

免费程序如下：

8、配套的质粒&菌株有哪些？

产品名称	交付标准	数目	储存条件
Y187 Yeast Strain	50 µl	1	-80℃
pGADT7 Vector	2 µg	1	-20℃
阳性对照诱饵	2 µg	1	-20℃
pHIS2-Motif(8N)	5 µg	1	-20℃
pHIS2 Vector	2 µg	1	-20℃
阳性对照猎物	2 µg	1	-20℃

9、自己不想做（或没把握做好），公司能提供筛选的服务吗？

可以的，我们会给您最终筛选到的motif序列，您可以自行进行数据分析，找到对应的调控基因。

10、motif文库可以扩繁吗？

每次扩繁都会丢失一部分克隆，我们提供的文库，理论上可以进行2~3次扩繁，不推荐超过3次。

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