实验方法

1.小分子RNA设备

　　人组织及细胞系小分子RNA (≤200nt) 的提取可以采用不同的方法和试剂盒制备。下面以mirVana^TM miRNA提取试剂盒为例，按照说明书简述提取方法如下。

　　(1)取适量组织(≤250mg)，于液氮中研磨成粉末，转移至600μL裂解/结合缓冲液中E如果从培养的细胞中提取小RNA,收集细胞(≤10⁷个细胞)后可直接用裂解/结合缓冲液裂解/再加人60μL miRNA匀浆液，在冰上放置10min。

　　(2)加入600μL酚/氯仿，剧烈混匀30-60s后，于室温以10000r/min离心5min (完全分层)。小心吸取上清转移至以新的无RNase1.5mL离心管中。

　　(3)加入1/3体积的无水乙醇，完全混匀后加人到装在收集管中的离心柱中(每次最多700μL)，室温以10000r/min离心1min,收集流出液。

　　(4)在收集的流出液中再加人其2/3体积的无水乙醇，完全混匀后再加人到装在收集管中的另一新的离心柱中，室温以10000r/min离心1min,弃掉流出液。

　　(5)离心柱中加入700μL mirVana^TM miRNA提取试剂盒中的洗液1，离心5-10s漂洗。

　　(6)再按上述方法用500μL试剂盒中的洗液2和3各漂洗一次，再离心1min,以完全去掉乙醇。

　　(7〉加100pul室温的洗脱液，10000r/min离心1min,回收RNA。

　　(8)紫外分光光度计测其OD₂₆₀及OD₂₈₀的值，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值大于1.8吋，表明RNA纯度较好，根据OD₂₆₀计算RNA液度。

2.Poly(A)加尾

　　取2μg小分子RNA,分別加人5μL 10 X Poly (A)聚合酵缓冲液、5μL 25mmol/LMnCl₂、5μL 10mmol/l DTT、100mmol/l ATP 0.5μL、Poly (A)聚合酶4.5U，最后加水补充至50μL。37℃反应30min。反应后补充50μL,DEPC水，再用等体积水饱和酚/氯仿及等体氯仿分別抽提一次。上清移至另一微量离心管中，加人10μL 3mol/L CH₃COONa(pH5.2)及250μL无水乙醇，-20℃放置60min。于4℃ 12000r/min离心15min,用75%乙醇漂洗沉淀，室温干燥后溶于7μLDEPC赴理水中。

3.5’RNA接头连接:

　　取7μL Poly (A)加尾的小分子RNA加人到0.25μg冻干的GeneRacer^TM RNA Oligo中，使RNA接头完全溶解，于65℃温育5min以去除RNA的二级结构，冰上放置2min并稍离心。然后依次加人下列成分:分別加人1μL 10X T4RNA连接酶缓冲液、lμL 10mmol/L ATP、1μL RNaseOut^TM (40U/μL)、 1μL T4 RNA连接酶(5U/μL)，总体积10μL。37℃反应lh,补充90μLDEPC水，用等体积水饱和酚/氯仿及等体氯仿分別抽提一次。上清移至另一微量离心管中，加入10pμL 3mol/L CHgCOONa (pH5.2〉 及250μL无水乙醇，-20℃放置60min。于4℃ 12000r/ min离心15min, 用75%乙醇漂洗沉淀，室温干燥后溶于10μLDepC处理水中。

4.cDNA合成

　　上述经过Poly (A)加尾并连接有RNA接头的小分子RNA反转录以后即可作为PCR的模板。在上述加接头后得到的10μL溶液中加人1μg RT引物及1μL 10mmol/L dNTP,65℃変性5min后冰上冷却。再加入4μL 5X反转录酶反应缓冲液、1μL 0.1mol/L DTT、1μL, RNaseOut及lμL反转录酶SuperScript Ⅲ (200U/μL, 组成20μL,的反立体系。于50℃反应1h, 75℃处理15min以灭活反转录酶。制备的cDNA可保存于-20℃各用。

5.PCR扩增cDNA及PCR产物的回收

　　取1μL cDNA,分别加入2μL PCR引物1和引物2的混合物(10pmol)、 5μL 10X PCR缓冲液、4μL 2. 5mmol/L dNTP及2.5U Taq酶，加水至50μL。反应条件如下: 94℃4min,再执行94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s共25个循环，72℃保温10min。PCR产物用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶和1X TBE缓冲液电泳分离，电泳结束后用溴化乙锭染色。在紫外灯下切下约110bp附近的DNA条带。在微量离心管中将凝胶挤压成粉末，然后加人500μL洗脱缓冲液(O. 3mol/L NaCl), 37%C 洗脱过夜。于12000r/min离心5min，上清移至另一新的微量离心管中，再按前述方法用Tris饱和酚/氯仿及氯仿分别抽提一次，转移上清液，加入1/10体积的3mol/L CH3COONa (pH5.2) 及2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀60min。于4℃ 12000r/min离心15min,用75%乙醇洗沉淀，室温干燥后溶于10μL无菌水中。

　　图1-1所示为克隆人胎肝小分子RNA的PCR扩增cDNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图中第2、3、4、5泳道为PCR产物。由于miRNA的长度为22nt左右，加上接头长度和反转录引物的长度，预期的miRNA经加接头、加尾后的长度为100nt大小。因此，为了准确获得预期条带的位置，在第1、6泳道加入了109nt 的分子量标准。依据电泳结果，即可回收109nt附近的目的条带，用于后续实验。

图1-1小RNAPCR扩增产物10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳M-DL2000 DNA分子量标准; 1,6-109bp DNA; 2-5一小RNA PCR扩增产物

6.连接、转化、筛选和测序

(1)连接

　　回收的PCR产物与pGEM-T载体进行连接，按照pGEM-T载体操作手册操作。在0.2mL离心管中依次加入5pL 2X连接缓冲液、lμL pGEM-T载体(50ng)、 3μL回收产物、1μL T4 DNA连接酶，混匀后4C连接过夜。

(2)转化

　　将10μL的连接产物用无菌吸头加到100pL DH5a感受态细菌中，轻轻吹打混匀，在冰中放置30min后，立即转移到42℃水浴中90s，然后快速转移到冰上，冷却1~2min，加人800pL无抗生素LB, 37%C摇床培养1h, 5000r/min离心5min，弃去多余700μL上清，混匀后用弯头玻棒均匀涂布到含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养12-16h。

(3)菌落PCR鉴定

　　从转化平板上挑取克隆，接种到LB培养基中，37℃培养5~8h，至对数生长期取出少量菌液用引物1及引物2进行菌落PCR初步鉴定。PCR体系如下: 2μL dNTP (2. 5mmol/L),2μL10XPCR缓冲液，5pmol 引物1，5pmol 引物2，1U Taq聚合酶，加水至20μL。反应;条件: 94℃ 2min, 94℃ 30s、55℃ 30s、 72℃ 60s，共30个循环，最后72℃ 10min。

　　图1-2是制备人胎肝小RNA分子克隆的菌落PCR鉴定结果。回收图16-1中约109bp的DNA片段，连接到PGEM-T载体上，转化后菌落PCR鉴定。泳道1~12代表不同的菌落，绝大部分菌落的PCR产物大小接近预期的PCR扩增产物109nt左右的大小，选取相应的阳性克隆测序。

图1-2 菌落PCR鉴定重组质粒M-DL2000 DNA分子量标准; 1-12:菌落PCR产物

(4)测序:

　　对初步鉴定的克隆进行测序。

7.序列分析

　　对候选的miRNA序列进行分析，获得已知的miRNA分子，按照miRNA分子标准确认新的miRNA及其基因。

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