蛋白冻干

众所周知，重组蛋白本身稳定性较差,这在一定程度上制约了重组蛋白的发展和应用，而解决这一问题最好是采用冻干的方法。
冻干技术的基本原理是把重组蛋白溶液先在低温环境下冻结,再在真空条件下干燥,形成重组蛋白固体制剂。其中干燥过程又可分为去除结晶水的初步干燥和去除结合水的二次干燥。但是由于冻干过程实质上是物质和能量的转换过程,因此冷冻干燥本身也会给重组蛋白带来负面影响,导致重组蛋白发生变性作用 。

1、冷冻过程的变性机理

冷冻过程的变性机理主要包括低温变性和冷冻变性 ，其中冷冻变性的因素较为复杂，有形成分枝状冰晶、增加 离子强度、改变ph值和发生相分离等。

1.1、低温变性机理

低温之所以能够引起变性是因为非极性基团在水中的溶解度随温度降低而增加,导致重组蛋白中的疏水作用在弱。像热变性一样,低温变性也是由焓驱动的。低温变性对寡聚蛋白影响比较大,因为寡聚体之间的相互作用实际上是疏水作用，理论上来说疏水作用力力即解折叠自由能和温度之间呈抛物线关系 ，这就意味着重组蛋白不但有最稳定对应温 度,还有不稳定对应最高温度和最低温度。

1.2、冷冻变性机理

冷冻变性主要包括4个方面的影响： 浓缩影响、冰水界面的影响、ph值变化的影响和相分离的影响 。对不同重组蛋白来说,这些影响可能同时起作用，也有可能只是部分起作用。

2、干燥过程的变性机理

干燥过程的变性主要是发生在去除结合水的二次干燥阶段。重组蛋白在水溶液中是水化的，水化的重组蛋白表面有一 层水分子包裹,构成了一个单分子层,这就是水化层，这层水分子是通过氢键和蛋白相互作用的 。干燥过程势必要去除一部分水化层的水,而去除水化层的水破坏了蛋白质表面的氢键结构,可能会引起重组蛋白天然结构的变性，这是由于失去 氢键的重组蛋白可能把质子转移给羧基,减少了重组蛋白中的电荷分布，电荷密度的降低增强了重组蛋白之间的疏水作用,促进凝聚的形成，导致变性。

3、保护措施—保护剂

加入添加剂能够有效减少或阻止冻干对蛋白质带来的变性影响,这些添加剂也被称之为保护剂，冻干配方中最常用的是糖类和高分子化合物。
糖类中常用的是二糖, 蔗糖和海藻糖是最常用的二糖，相对于蔗糖来说,海藻糖用来保护重组蛋白的效果更好,这是因为海藻糖的玻璃态转化温度比较高 。此外,海藻糖还有一些优点，比如吸水性小，自身分子内部不形成氢键,有利于和重组蛋白形成氢键，低的化学反应性。因此在许多重组蛋白的冻干配方中使用海藻糖。
高分子化合物中经常用的是血清白蛋白，它既可以作为冷冻保护剂也可以用作干燥保护剂，它保护蛋白的效果得到广泛的认可，但是由于它可能含有病原 体,这阻碍了它的应用，现在一般用重组人白蛋白代替血清白蛋白作为蛋白质的保护剂。

随着冻干技术的研究的深入和广泛应用,冻干机理的研究已经逐步从定性转变为定量,建立了各种数学模型。但实际上冻干技术仍是一门边缘技术,需要生物学、物理化学、药学、制冷、真空和控制等知识交叉和综合运用,因此还存在许多亟待解决的问题，例如变性和保护的机理尚未完全研究透彻,各种数学模型还没有形成完善的机制,保护剂的研究之路还很漫长。

随着后基因组时代—蛋白质组的到来,基因工程药物的快速发展,冻干技术的研究将会不断的深入,变性和保护机理将被不断深入理解, 冻干技术必将为重组蛋白质的研发作出重要贡献。

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