哺乳动物蛋白表达案例

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本案例基于pAZV5分泌表达体系,使用基因合成的方法构建pAZV5表达载体,瞬时转染HEK293悬浮细胞,通过SDS-PAGE和 Western Blot检测蛋白的表达情况,扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。

一、实验设计 
我们分析客户提供的Target-Gene序列,整个蛋白序列呈亲水性,自身不带信号肽序列,因此我们设计思路为:
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板,通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5载体来进行实验,利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外,为了保持蛋白的N端活性,我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路,以基因合成的方式构建pAZ-V5表达质粒,经过测序和酶切验证无误后,挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞,通过western blot检测蛋白表达情况,确认蛋白表达情况,再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材

名称 公司 名称 公司
DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂 Invitrogen(Gibco) 无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、低熔点琼脂糖 Sigma公司
抽提试剂盒 Axygen公司 PCR试剂盒 IO-RAD公司
六孔板、细胞培养瓶、离心管 corning公司 PCR反应管 Fisher公司
DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒 AXYGEN公司 Agarose 上海基因公司
中性红 碧云天生物公司 其它试剂均为国产分析纯

二、主要实验仪器

仪器名称 公司 仪器名称 公司 仪器名称 公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 美国BECKMAN公司 台式高速离心机 德国SORVAL公司 Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统 美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪 美国MJ Research公司 320-S pH计 美国Mettler Toledo公司 AR5120电子天平 美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪 美国Amersham Pharmacia公司 雪花状制冰机 日本SANYO公司 JY92-2D超声波细胞粉碎机 中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪 南京大学普阳科学仪器厂 NANODROP2000 美国Thermo公司 超净工作台 中国苏净集团

四、蛋白性质分析
4.1 客户提供原始基因序列
GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容,不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT
4.2 编码的蛋白序列如下(理论分子量41.18KD,理论等电点PI6.73)
GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容,不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL

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4.3 稀有密码子序列分析如下图所示(红色:使用频率低于10% 灰色:使用频率低于20%,绿色为正常频率密码子)

稀有密码子序列分析 稀有密码子序列分析

4.4 蛋白序列跨膜及亲疏水性分析

蛋白亲疏水性分析 蛋白序列跨膜分析

4.5 信号肽预测

蛋白亲疏水性分析 蛋白序列跨膜分析

综上所述:
1、蛋白理论分子量为 41KD,属于正常分子量范围,较适宜表达。 
2、通过对基因密码子使用频率的分析,如果以293细胞为表达宿主,基因序列上使用频率低于20%的密码子X个,使用频率低于10%的密码子X个,优化后通过基因合成方式获得目的基因。 
3、通过对蛋白的跨膜结构和亲疏水性分析,蛋白整体呈亲水性,但从473AA之后,蛋白存在典型的跨膜结构,建议去除后表达以提高成功率。 
4、目的蛋白自身无信号肽,添加GP67信号肽便于蛋白分泌表达。为了纯化方便,考虑在C端添加His标签。

五、实验方法及实验结果
5.1 pAZ-V5表达质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因,双酶切连接至pAZ-V5载体的Afl II和Xba I之间;将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果拼接如下所示,单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点,黄色区域为v5信号肽,绿色区域为6XHis标签;
T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G
5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下:

测序峰图

5.3 pAZ-V5载体图如下所示:
 
pAZ-V5质粒酶切图与载体构建示意图

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