哺乳动物蛋白表达案例

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本案例基于pMZ-X3分泌表达体系,使用基因合成的方法构建pMZ-X3表达载体,瞬时转染HEK293悬浮细胞,通过SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白的表达情况,扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。未经钟鼎生物授权,任何单位及个人不得转载或盗用,违者必究!

一、实验设计 
我们分析客户提供的Target-Gene序列,整个蛋白序列呈亲水性,自身不带信号肽序列,因此我们设计思路为:
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板,通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pMZ-3X载体来进行实验,利用载体自带的X3信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外,为了保持蛋白的N端活性,我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路,以基因合成的方式构建pMZ-X3-target-gene表达质粒,经过测序和酶切验证无误后,挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞,通过western blot检测蛋白表达情况,确认蛋白表达情况,再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材
DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂等购自Invitrogen(Gibco)无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂等(购自Sigma公司)、抽提试剂盒(购自Axygen公司)、PCR试剂盒(IO-RAD公司) 、六孔板(购自corning公司)、细胞培养瓶(购自corning公司)、离心管(购自corning公司)、PCR反应管(购自Fisher公司)、Agarose(购自上海基因公司)、DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自AXYGEN公司)、低熔点琼脂糖(购自sigma公司)、中性红(购自碧云天生物公司)、其它试剂均为国产分析纯。

三、主要实验仪器
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 (美国BECKMAN公司),台式高速离心机(德国SORVAL公司),Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统(美国BIO-RAD公司),PTC-200基因扩增仪(美国MJ Research公司)
320-S pH计(美国Mettler Toledo公司),AR5120电子天平(美国AHOM S公司),MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪(美国Amersham Pharmacia公司),雪花状制冰机(日本SANYO公司),JY92-2D超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所),蛋白核酸检测仪(南京大学普阳科学仪器厂),超净工作台(中国苏净集团),NANODROP2000(美国Thermo公司)

四、蛋白性质分析
4.1 客户提供原始基因序列
GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容,不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT
4.2 编码的蛋白序列如下(理论分子量41.18KD,理论等电点PI6.73)
GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容,不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL

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4.3 稀有密码子序列分析如下图所示(红色:使用频率低于10% 灰色:使用频率低于20%,绿色为正常频率密码子)

稀有密码子序列分析 稀有密码子序列分析

4.4 蛋白序列跨膜及亲疏水性分析

蛋白亲疏水性分析 蛋白序列跨膜分析

4.5 信号肽预测

蛋白亲疏水性分析 蛋白序列跨膜分析

综上所述:
1、蛋白理论分子量为 41KD,属于正常分子量范围,较适宜表达。 
2、通过对基因密码子使用频率的分析,如果以293细胞为表达宿主,基因序列上使用频率低于20%的密码子X个,使用频率低于10%的密码子X个,优化后通过基因合成方式获得目的基因。 
3、通过对蛋白的跨膜结构和亲疏水性分析,蛋白整体呈亲水性,但从473AA之后,蛋白存在典型的跨膜结构,建议去除后表达以提高成功率。 
4、目的蛋白自身无信号肽,添加GP67信号肽便于蛋白分泌表达。为了纯化方便,考虑在C端添加His标签。

五、实验方法及实验结果
5.1 pMZ-X3-gene表达质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因,双酶切连接至pMZ-X3载体的Afl II和Xba I之间;将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果拼接如下所示,单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点,黄色区域为X3信号肽,绿色区域为6XHis标签;
T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G
5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下:

测序峰图

5.3 pMZ-X3-gene质粒酶切图与载体构建示意图如下所示:
 
pMZ-X3-gene质粒酶切图与载体构建示意图

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