2024年10月诺贝尔生理学奖或医学奖Victor Ambros 和 Gary Ruvkun 两位科学家，以表彰他们发现了 miRNA（microRNA）及其在转录后基因调节中的作用，并阐明了控制基因活动的基本原则。

这一发现起源于秀丽隐杆线虫的研究过程中，Lin-4基因编码了一种小RNA分子，它通过与Lin-14基因的mRNA结合，从而抑制其翻译，就像基因表达的“刹车”，miRNA可以精准地调控mRNA的翻译速度。

这是诺奖连续第二年授予RNA相关的研究领域，一度被冠以“过气网红”的miRNA再次被推到风口浪尖。其实非编码 RNA 研究发文章相对容易，只要实验设计上没有太大的问题，结果有理有据，一般都可以发表在中等影响因子的期刊上。下面我们简单介绍一下miRNA（microRNA）与靶基因互作的研究思路。

microRNA与靶基因的靶向互作研究思路

确定研究表型的miRNA：一般来源于测序或者文献调研。
miRNA的定量：qPCR、Northern、细胞功能实验。
确定miRNA在某种感兴趣的表型中靶基因：生信分析结合文献，预测靶基因可以参考下表的软件预测靶基因3‘UTR与miRNA的结合位点。预测的靶基因成千上万，通过查阅文献，进一步确定miRNA和靶基因的靶向关系。

预测网址

TargetScan:https://www.targetscan.org/vert 80/
网址特点：miRNA种子区域(第2-8nt序列)与靶基因是否结合(经典结合方式)进行预测，10个物种，常用

starbase:https://starbase.sysu.edu.cn/
网址特点：按照经典结合方式进行预测，非编码RNA-miRNA

miRDB:http://www.mirdb.org/
网址特点：按照经典结合方式进行预测，5个物种，可对给定序列进行匹配

RNAhybrid:https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/
网址特点：基于热动力学因素对miRNA与靶基因形成的复合结构的自由能进行预测(非经典结合方式)

验证miRNA与靶基因的靶向关系：常用的方法包括双荧光素酶报告基因系统。其具体步骤是：

①将待研究的靶点序列（如mRNA的3'UTR或lncRNA/circRNA序列）插入到报告载体中，作为萤火虫荧光素酶的3'UTR。
②将该报告载体与microRNA的mimic共同转染细胞。
③观察荧光素酶表达量的变化，如果荧光素酶表达量下降，则提示序列包含microRNA的靶点。

确认生物学功能：免疫荧光、细胞功能实验、动物实验。

文献解读

文献一（动物）

1.Long non-coding RNA NORAD/miR-224-3p/MTDH axis contributes to CDDP resistance of esophageal squamous cell carcinoma by promoting nuclear accumulation of β-catenin（IF=41.4）

作者首先介绍了研究的背景，即食管鳞状细胞癌（ESCC）的顺铂（CDDP）耐药问题，以及长链非编码RNA（lncRNA）NORAD在其中的潜在作用。基于现有的研究基础和实验数据，作者提出了一个假设，即NORAD可能通过某种机制影响ESCC细胞的CDDP耐药性。

为了验证这个假设，作者构建CDDP耐药的ESCC细胞系，检测NORAD在这些细胞中的表达水平，以及通过基因敲低和过表达技术来探究NORAD对ESCC细胞CDDP耐药性的影响。

在确定了NORAD的作用后，作者进一步探究了其分子机制。他们通过RNA免疫共沉淀等技术，鉴定了NORAD的靶标miRNA（miR-224-3p），并发现NORAD能够海绵吸附这个miRNA，从而调控其靶基因MTDH的表达。为了验证这一机制，作者还使用了荧光素酶报告基因实验。

作者构建了含有miR-224-3p潜在结合位点的荧光素酶报告基因质粒，并将其转入细胞中。然后，他们通过检测荧光素酶的活性来评估miR-224-3p与这个结合位点的相互作用。当NORAD存在时，它能够海绵吸附miR-224-3p，从而降低荧光素酶的活性；而当NORAD被敲低时，荧光素酶的活性则会增加，因为此时有更多的miR-224-3p能够与报告基因质粒中的结合位点结合。

通过这一实验，作者成功地验证了NORAD与miR-224-3p之间的相互作用，并进一步支持了他们提出的分子机制。

文献二（植物）

2.Intronic microRNA-directed regulation of mitochondrial reactive oxygen species enhances plant stress tolerance in Arabidopsis(IF=10.2)b

研究团队关注到了重金属污染（特别是镉Cd的积累）已成为全球环境问题，对植物产生负面影响，诱导细胞不同部位产生活性氧物种（ROS）。植物已进化出多种机制以应对镉毒害和增强耐受性，但内含子（IR）在调控miRNA功能及植物应激适应中的作用尚不清楚。

研究团队提出了一个假设：存在一种应激响应的RNA剪接机制，能够影响内含子miR400的产生，进而调控ROS积累并改善植物耐受性。

为了验证这一假设，他们设计了实验，使用内含子miR400剪接依赖的荧光素酶报告基因来监测内含子剪接事件，并研究其对ROS积累和植物耐受性的影响。通过实验，研究团队观察到在镉处理下，特定的基因表达模式改变，与ROS产生和清除相关的酶活性发生变化。

他们发现，内含子miR400通过下调其靶标表达来调控ROS积累，并影响植物的应激耐受性。使用荧光素酶报告基因，他们证实了内含子剪接是内含子miR400产生中的关键步骤，并强调了内含子miRNA在增强植物应激耐受性中作为“信号转导器”的功能。

案例展示

植物叶片的荧光成像 ，直观展示干扰表达的效果。

案例一

①pGreenII 0800-miRNA+pGreenII 62-SK
②pGreenII 0800-miRNA - A+pGreenII 62-SK
③pGreenII 0800-miRNA+pGreenII 62-SK- B
④pGreenII 0800-miRNA -A+pGreenII 62-SK- B

案例二

①pGreenII 0800-miRNA+pGreenII 62-SK
②pGreenII 0800-miRNA - C+pGreenII 62-SK
③pGreenII 0800-miRNA+pGreenII 62-SK-D
④pGreenII 0800-miRNA - C+pGreenII 62-SK-D

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