以萤火之光点亮转录因子和启动子互作研究-荧光素酶报告基因

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荧光素酶报告基因是分子机制研究中一个非常经典的实验,五分以上的文章经常能看到它的身影,除了我们上一篇提到的在microRNA与靶基因的靶向互作中的应用,它还有另一个重要的用途:转录因子和启动子调控机制的研究。

以萤火之光点亮转录因子和启动子互作研究

在生物医学研究中,转录因子(TFs)扮演着基因表达调控的关键角色。它们能够识别并结合到DNA上的特定序列,从而激活或抑制基因的转录。理解转录因子与启动子之间的相互作用对于揭示基因调控网络、疾病机制以及药物开发具有重要意义。



转录因子与启动子互作的研究思路

miRNA与靶基因的靶向互作研究思路

1、确定启动子:利用生物信息学工具和数据库明确自己感兴趣的启动子序列;
2、预测转录因子:通过JASPAR: https://jaspar.genereg.net/(最常用)或者PROMO:http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3来预测;

预测转录因子

3、验证结合:
(1)体外实验:
①EMSA:检测转录因子与启动子DNA序列的结合能力,可用于定性和定量分析。
②DNA Pull-down实验:通过生物素标记的启动子DNA片段与转录因子结合,再利用链霉亲和素磁珠进行捕获,最后通过质谱鉴定结合的转录因子。
(2)体内实验:
①ChIP:通过特异性抗体富集与转录因子结合的DNA片段,再通过qPCR定量分析,验证转录因子是否与启动子结合。
②酵母单杂交:将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子上游,并在其下游连上报告基因。编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域融合表达载体被转化进酵母细胞,如转录因子能够和顺式作用元件结合,就能激活Pmin启动子,使报告基因得到表达。
③荧光素酶报告基因系统:

荧光素酶报告基因系统

[1]将待研究的启动子序列插入报告载体的上游。
[2]将该报告载体与转录因子共同转染细胞。
[3]加入底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光,通过荧光的强弱判断荧光素酶表达量的变化,如果荧光素酶表达量上升,则提示启动子与转录因子有结合。



文献解读

文献一

1、The DnaJ domain-containing heat-shock protein NAL11 determines plant architecture by mediating gibberellin homeostasis in rice (Oryza sativa) IF= 10.3(署名钟鼎生物)

这是一篇发表在《 New Phytologist》(IF= 10.3)的文章,作者为华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心陈志强教授团队。他们发现NAL11是一个关键的株型调控基因,其稀有等位基因NAL11−923del−1552通过逃避IPA1的转录抑制而上调表达,进而通过调节GA稳态来塑造理想的水稻株型。这一发现为利用NAL11进行高产水稻育种提供了理论依据。

荧光素酶报告基因

首先,作者通过分析3K水稻基因组数据库,鉴定出NAL11基因的变异情况,发现一个缺失了部分启动子片段的稀有等位基因NAL11−923del−1552在Aus栽培种中被正向选择。通过qRT-PCR分析发现,该等位基因的表达水平显著上调。

荧光素酶报告基因

图1:NAL11-923del-1552增强了表达水平并在cA(Aus)生态型品种中受到正选择


然后,作者利用近等基因系(NIL)和CRISPR/Cas9基因编辑技术,分别在02428和ZH11背景下敲除NAL11基因,观察到敲除突变体表现出更多的分蘖、细茎和小穗等不良株型特征。接着,通过遗传互补实验和过表达实验进一步验证了NAL11在调控水稻株型中的关键作用。

荧光素酶报告基因

图2:NAL11调控水稻分蘖数、茎秆与穗型等株型性状


作者通过酵母单杂交、电泳迁移率变化分析(EMSA)、染色质免疫沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)等实验,揭示了IPA1可以直接结合到NAL11启动子的缺失片段上,并负向调控NAL11的表达。通过LUC转录激活分析证实了pNAL11-923del-1552在缺失了3个motif后,部分绕过了IPA1的负调节作用,从而释放了NAL11的表达,促进了理想株型建成。进一步,从遗传上充分验证了NAL11作用于IPA1的下游,并且通过影响GA稳态调控水稻株型。

荧光素酶报告基因

图3:NAL11-923del-1552部分避开IPA1的负调控而有更高转录活性



文献二

2、Endothelial UCP2 Is a Mechanosensitive Suppressor of Atherosclerosis(IF=23.3)

这是一篇发表在《Circulation Research》(IF:23.213 )上的研究论文,作者为香港城市大学黄聿教授团队以及上海交通大学医学院附属新华医院心血管发育与再生医学研究所骆江云团队。他们发现解偶联蛋白2(UCP2)是一个受血流剪切应力和KLF2调控的新型机械敏感基因。UCP2 表达下调对内皮细胞炎症反应和动脉粥样硬化形成至关重要。这项研究提示:靶向KLF2-UCP2通路可能是抗动脉粥样硬化的一种有效的治疗新策略。

荧光素酶报告基因

作者首先通过体外实验,利用模拟系统研究了不同剪切流(振荡剪切流和单向剪切流)对内皮细胞中UCP2表达的影响,发现UCP2的表达受剪切流的调控,且这种调控依赖于KLF2。进一步的体外实验表明,UCP2的敲低会诱导内皮细胞表现出促炎症和促纤维化的表型,提示UCP2在内皮细胞炎症反应中可能发挥重要的调节作用。

荧光素酶报告基因

图1:KLF2转录调节UCP2表达

为了验证UCP2在动脉粥样硬化中的作用,作者构建了内皮细胞特异性Ucp2基因敲除小鼠和过表达小鼠模型。通过高脂饮食和部分颈动脉结扎手术诱导动脉粥样硬化,发现UCP2的缺失会加重动脉粥样硬化斑块的形成和胶原蛋白沉积,而UCP2的过表达则具有保护作用,显著减少了斑块的形成。这些结果表明UCP2在动脉粥样硬化的发展中具有重要的保护作用。

荧光素酶报告基因

图2:UCP2对动脉粥样硬化的影响

最后,作者通过RNA测序分析和分子实验,揭示了UCP2调控炎症的分子机制。研究发现,UCP2的敲低激活了FoxO1这一关键的促炎症转录因子,而FoxO1的激活进一步促进了炎症基因的表达。此外,作者还发现UCP2通过调节AMPK的活性来影响FoxO1的活性,进而调控炎症反应。这一发现为开发针对动脉粥样硬化的潜在治疗策略提供了新的靶点。

在这篇文章中,荧光素酶报告基因实验起到了关键的作用,实验结果显示,野生型KLF2能够显著增加UCP2启动子的荧光素酶活性,表明KLF2能够正向调控UCP2的转录。

相反,KLF2的DNA结合缺陷突变体(KLF2ΔZnF)则不能增加UCP2启动子的活性,进一步证实了KLF2通过其DNA结合域直接调控UCP2启动子。作者证实了KLF2能够直接结合到UCP2启动子区域,并正向调控UCP2的转录活性。这一发现不仅揭示了UCP2是一个新的KLF2靶基因,还为理解UCP2在内皮细胞中的调控机制提供了重要依据。

荧光素酶报告基因

图3:双荧光素酶活性测定结果显示KLF2调节UCP2


案例展示

植物叶片的荧光成像 ,直观展示转录因子与启动子结合强弱。

案例一

①pGreenⅡ62-SK+pGreenⅡ0800-LUC
②pGreenⅡ62-SK-a+pGreenⅡ0800-LUC
③pGreenⅡ62-SK+pGreenⅡ0800-LUC-b
④pGreenⅡ62-SK-a+pGreenⅡ0800-LUC-b

文献案例1
文献案例1


案例二

①pGreenII 0800-LUC+pGreenII 62-SK
②pGreenII 0800- LUC +pGreenII 62-SK-b
③pGreenII 0800- LUC-a+pGreenII 62-SK
④pGreenII 0800- LUC-a+pGreenII 62-SK-b

文献案例1
文献案例1




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