双荧光素酶报告系统简介

    荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

    双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase®）可以同时检测萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，F-Luc)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，R-Luc)的活性，先以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾荧光素酶，并且在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾荧光素酶的活性，实现双荧光素酶报告基因检测。其中F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变，R-Luc作为内参基因，为实验提供统一基准线（减少内在变化因素如样品数目，转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。

应用介绍

    F-Luc表达框的上游启动子区域插入不同功能序列，通过转录条件的改变造成其报告基因荧光值的变化。F-Luc的3’UTR区域替换成靶基因的3’UTR，过表达microRNA，可以反映是否存在靶向互作。

1、启动子活性验证

   转录因子主要是通过作用于靶基因的启动子起作用，将报告基因F-Luc的启动子替换为目的基因启动子区序列，通过与转录因子共表达后，观察报告基因荧光值的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

2、miRNA靶基因验证

    miRNA主要是作用于靶基因的3’UTR起作用，将目的基因3’UTR序列构建至报告基因F-Luc载体中的3’端，通过与过表达miRNA比较后，报告基因荧光值的改变来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

技术路线

   1、根据实验目的设计实验方案
   2、构建报告基因载体
   3、共转染烟草
   4、荧光检测
   5、计算相对荧光强度，进行数据分析

优势

   1、萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶反应都为发光反应，检测方式一致；
   2、两种反应检测灵敏度与检测范围近似，可以检测到更小的量和更大的范围两种发光反应底物不同，不会相互影响；
   3、通过方法将两个检测串联起来，实现同一样品，两步检测，得到两个检测结果。

相关服务