荧光素酶酶活恢复法检测体内蛋白质互作

实验原理

来自萤火虫的荧光素酶可以分成N和C两段蛋白质而没有酶活，将N和C端各融合另外的两个蛋白质，如果这两个蛋白质在体内可以互作的话，那么荧光的N和C端将在空间上靠近而恢复酶活，因此可以通过检测分段的荧光素酶可否恢复酶活而判断两个蛋白质之间在体内是否存在相互作用。

实验目的:检测蛋白质之间的体内相互作用。

试剂:

原生质体转化相关试剂(参阅拟南芥或者水稻原生质体转化相关章节)

萤火虫荧光素酶底物(Promega, Luciferase Assay System)

GUS活性检测底物( MUG substrate )

仪器:

酶标仪

操作步骤:

1.载体构建:本操作系统的载体改造自PUC19-nLUC和PUC19-cLUC (由北京生命科学研究所，北京遗传与发育生物学研究所周俭民研究员提供)为了可以更方便酶切，分别改造PUC19-nLUC和PUC19-nLUC的多克隆位点，改造后载体命名为M-NLUC和M-CLUC。M-NLUC的多克隆位点为Kan I-BamHI-XhoI-ApaI-BInI-BstXI-A-NotI-SacII-SpeI-XbaI-SalI，M-CLUC的多克隆位点为: Kpn I -BamH I -Xho I -SalI -Apa I -BstX I -NheI -A-NotI -Spe I -Sph I -Xba I-PstI，以上所有酶切位点都是编码框融合的。将两个蛋白质分别与M-NLUC和M-CLUC融合连接。

2.抽提质粒:按QIAGEN的质粒提取试剂盒说明书进行提取高纯度质粒。

3.原生质体转化:按照原生质体转化章节的方法制备拟南芥原生质体。通过PEG介导的方法转化质粒，NLUC 和CLUC的质粒各转化10ug，同时共转化2ug 35S:GUS质粒作为内参对照，转化完成后培养16-20小时。

4.将培养完毕的原生质体高速离心1min,弃上清。

5.加入100ul裂解缓冲液(Promega, Luciferase Assay System 提供)，混匀30s,冰上放置。

6.加入5ul细胞裂解物到酶标板中，加入45ul底物(Promega, Luciferase AssaySystem),混匀2s, 10s后测量发出荧光的信号值。

7.荧光素活性测量完毕后，取5ul细胞裂解物，加入45ul MUG底物，37C培育30分钟，加入950ul Na2CO3 (0 2M)终止反应后，测量GUS活性。

8.利用GUS平衡各个转化之间的系统误差，计算荧光素酶相对活性，判断蛋白质之间是否互作。

注意事项:

1.本实验必须要设计严谨的对照。连有目的基因的载体必须分别和另外一一个空载体共转化，同时需要两个空载体之间共转化，以排除背景信号的影响。同时可以转化一对确定互作的蛋白质来评价系统的有效性。

2.必须共转一个恒定表达的别的报告基因(如GUS何来自海参的荧光素酶REN)来平衡化各个转化之间的系统误差和转化效率。

3.高纯度的质粒和高效的原生质体转化体系是保证实验成功的关键所在。

4.可以将相关元件连接改造到可以进行农杆菌介导的转化的载体上去，从而可以在体内稳定检测蛋白质之间的相互作用。

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