1、若主报告基因和内参基因不在一个载体上 应该如何确定两个质粒的比例？

一般需要进行预实验 基本原则是：
①内参基因被准确检测
②不干扰主报告基因表达

因此，选择内参载体时，首先考虑活性较弱的TK启动子驱动的载体，主报告基因质粒和内参质粒比例在10：1-100：1之间比较常见，但也可能超出范围，这主要取决于内参基因和启动子的种类.

2、单报告基因和双报告基因怎么选？

单报告基因检测实验往往会受到细胞活性、细胞数量和转染效率等因素的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为实验提供基准线，从而可以在最大程度上减小这些影响，使得数据结果更为可信。 当需要共表达多个报告基因，已建立内参体系或者实现多重信号检测，或是需要实现最高的检测精度时，则要进行生报告基因转染及检测。

3、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的区别？

①作用不同

目的序列与萤火虫荧光素酶基因共同构建在质粒载体上，用来观察目的基因的作用结果。因此萤火虫荧光素酶作为主报告基因，而海肾荧光素酶作为内参，用来平衡细胞数量、转染效率等误差。

②分子量不同

海肾荧光素酶分子量是36KD，萤火虫荧光素酶分子量是61KD.

③反应条件不同

萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发生反应,而海肾荧光素酶仅需要腔肠素和氧气即可发生反应。

④检测波长不同

萤火虫荧光素酶产生的光发射波长约560nm，呈黄绿色，而海肾荧光素酶产生的光发射波长约465nm，呈蓝色。

4、荧光素酶实验启动子与转录因子活性验证如何分组？

此实验一般用到以下5种质粒.

①一般来说，如果不做具体结合位点分组，那分组为下表:

实验分组	启动子	转录因子	内参
1	pGL3-basic-NC	pcDNA3.1-NC	PRC-TK
2	pGL3-basic-NC	pcDNA3.1-TF	PRC-TK
3	pGL3-basic-WT	pcDNA3.1-NC	PRC-TK
4	pGL3-basic-WT	pcDNA3.1-TF	PRC-TK

1、2组是为了验证转录因子不影响pGL3空载的表达，1、3组验证目的启动子是否具有活性，3、4组验证转录因子是否影响启动子活性。

②如果要分析具体的结合位点，需将结合位点进行突变，构建启动子突变型质粒。在上述分组中添加两个分组，即：

实验分组	启动子	转录因子	内参
1	pGL3-basic-NC	pcDNA3.1-NC	PRC-TK
2	pGL3-basic-NC	pcDNA3.1-TF	PRC-TK
3	pGL3-basic-WT	pcDNA3.1-NC	PRC-TK
4	pGL3-basic-WT	pcDNA3.1-TF	PRC-TK
5	pGL3-basic-mut	pcDNA3.1-NC	PRC-TK
6	pGL3-basic-mut	pcDNA3.1-TF	PRC-TK

这2组说明突变的位点是否为影响启动子与转录因子结合的关键位点，且每增加一个突变位点，需增加的对应的两组。

5、荧光素酶实验荧光值过高或过低怎么办？

荧光值一般在5-7之间，我们要从以下两方面进行检查：

荧光值过高

①减少质粒转染用量
②细胞样品裂解后，离心取上清，稀释裂解产物

荧光值过低

①可能是由于质粒转染效率低，可通过优化转染条件来解决
②样品裂解效率低，在加入充足裂解液基础上，应将裂解时间控制在24-48小时
③检测过程操作不规范，应室温条件下反应，即各个组分包括细胞裂解液、底物工作液都需要调整至室温。
④底物氧化失效，底物应按照试剂盒说明书妥善保存，反应工作液建议现用现配。

6、荧光素酶报告基因实验复孔间重复性差该如何处理？

该实验一般使用技术重复，其检测非常灵敏，技术重复的复孔之间的数值，有一定差异是正常的，如果检测数值相差太大，可按如下建议调整：

①保证样本的均一性，细胞裂解后，离心取上清检测；
②保证加样的准确性，移液器需定期校准，确保移液精准。
而如果是生物学重复的重复性差，可能是不同样本间的转染效率存在差异。

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