在药物靶点研究领域，以ABPP和DARTS等技术已广泛应用于潜在药物靶点的筛选。然而，这些方法仅能建立小分子与蛋白质相互作用的初步关联，却无法解析二者结合的三维空间构象特征及精确的分子作用位点。值得强调的是，结合位点的精准定位不仅是实现药物开发从"经验筛选"向"结构导向型理性设计"范式转变的关键枢纽，更能为阐释药物作用机制提供结构生物学证据，从而显著提升研究工作的科学价值与学术影响力。

基于此，我们今天介绍一种能够准确识别小分子化合物的结合位点，还可解析蛋白质-配体复合物的动态构象变化的技术-氢氘交换质谱（HDX-MS）。

氢氘交换质谱（HDX-MS）的原理是利用蛋白质主链上的酰胺氢（-NH）在溶液中可以与氘（D）发生交换。这种交换速率与蛋白质的构象密切相关：暴露在溶剂中的区域交换速率较快，而埋藏在蛋白质内部的区域交换速率较慢。

具体到小分子与蛋白结合位点上，当化合物与蛋白质结合时，结合位点附近的蛋白质构象会发生变化。这种变化会影响该区域的氢氘交换速率。通过比较蛋白质在结合化合物前后的氢氘交换速率，可以推断出化合物与蛋白质结合的具体位点。

交换后的蛋白质经过酶切，生成多个肽段。质谱仪通过检测肽段的质量变化（氘的引入会导致质量增加）来确定哪些肽段发生了氢氘交换，以及交换的程度。通过分析这些数据，可以将交换速率与蛋白质的氨基酸序列对应起来，从而定位结合位点。

1、实验设计

样品准备：分别准备未结合化合物的蛋白质样品（对照组）和结合化合物的蛋白质样品（实验组）。实验组中，蛋白质与化合物在适当的条件下孵育，以确保结合充分。
氘标记：将两组样品分别置于氘化缓冲液中孵育，使蛋白质主链上的酰胺氢与氘发生交换。孵育时间可以是几秒到几小时，以覆盖不同的交换速率。

2、样品处理

猝灭反应：在标记完成后，将样品的pH值迅速降至2.5左右，并将温度降至0℃，以终止氘交换反应。
酶解：使用胃蛋白酶等酸性酶将蛋白质酶解为肽段，便于后续质谱分析。酶解可以在溶液中进行，也可以在固定化的酶柱上完成。
分离与纯化：通过液相色谱分离肽段，并去除未交换的氘。

3、质谱分析

质谱检测：使用高分辨率质谱仪（如Orbitrap）对肽段进行质量分析。氘的引入会导致肽段质量增加，质谱仪通过检测这种质量变化来确定氘的摄取情况。
数据采集：采集全扫描质谱（MS）数据以获得肽段水平的氘摄取信息，必要时还可以采集肽段片段水平的数据（如通过ETD碎裂）以获得更高分辨率的氨基酸水平信息。

4、数据分析

比较交换速率：通过比较对照组和实验组的氘摄取曲线，确定化合物结合对蛋白质构象的影响。如果某个肽段在结合化合物后氘摄取速率显著降低，说明该区域可能与化合物结合。
定位结合位点：结合质谱数据和蛋白质序列信息，确定氘摄取变化的肽段位置，从而推断化合物的结合位点。
辅助验证：通过定点突变等技术对推断的结合位点进行验证，进一步确认其准确性。

5、结果解读

构象变化：氘摄取速率的变化不仅反映了结合位点，还可以揭示化合物结合引起的蛋白质构象变化。
动态信息：HDX-MS还可以提供蛋白质动态结构信息，帮助理解结合过程中的构象变化。

通过上述步骤，HDX-MS能够有效地定位化合物与蛋白质的结合位点，并揭示结合对蛋白质结构和动态的影响。

高灵敏度和分辨率
HDX-MS能够检测到蛋白质中单个氨基酸残基的动态变化，具有高分辨率，可以精确地定位蛋白质的结构变化。

样品需求量少
该技术对样品的需求量相对较少，通常只需要不少于200微克的蛋白质样品，这使得它在样品有限的情况下仍然适用。

天然状态分析
HDX-MS允许蛋白质在接近天然的溶液环境中进行分析，不需要对蛋白质进行化学修饰或标记，从而能够更真实地反映蛋白质的结构和动态。

时间分辨能力
HDX-MS能够观察蛋白质结构随时间的动态变化，这对于研究蛋白质的折叠、稳定性和相互作用等过程非常有用。

不受分子量限制
与某些其他技术（如核磁共振）不同，HDX-MS不受蛋白质分子量的限制，可以用于分析大型蛋白质复合物。

多重信息获取
HDX-MS可以提供关于蛋白质二级和三级结构的信息，以及蛋白质与配体或蛋白质之间的相互作用位点，具有多重信息获取的能力。

不足:

数据分析复杂：HDX-MS生成的数据通常较为复杂，需要专业的软件和算法进行分析。谱图重叠现象可能导致氘代值的错误计算，增加了数据分析的难度。
实验条件控制要求高：HDX-MS实验需要严格控制实验条件，如温度、pH值等，以确保氢氘交换的准确性和可重复性。这些条件的控制对实验操作提出了较高的要求。
样品纯度要求低但复杂样品处理难度大：虽然HDX-MS对样品纯度的要求相对较低，但复杂的样品混合物可能会增加数据分析的复杂性，需要额外的处理步骤来确保结果的准确性。
技术门槛较高：HDX-MS技术需要专业的质谱设备和操作人员，技术门槛较高，这可能限制了其在一些实验室的普及和应用。

Conformational Dynamics of the Helix 10 Region as an Allosteric Site in Class A βLactamase Inhibitory Binding（IF=15.8）

抗生素耐药性（尤其是β-内酰胺类抗生素耐药性）是临床治疗的重大挑战。A类β-内酰胺酶（如TEM1、SHV1、PC1）能水解β-内酰胺类抗生素，导致耐药性。BLIP（β-内酰胺酶抑制蛋白）是一种天然抑制剂，对TEM1抑制效果显著，但对SHV1和PC1较弱。该研究通过多技术联用，首次全面揭示了A类β-内酰胺酶与BLIP结合时的构象动态差异，提出H10区域作为关键变构位点的重要性。研究结果为克服抗生素耐药性提供了新思路，即通过调控蛋白质动态特性设计高效抑制剂。

研究背景

研究结果

一、IM-MS 揭示A类β-内酰胺酶的全局构象

游离的β-内酰胺酶以及与BLIP结合后复合物的迁移时间分布差异均不大;
表明结合BLIP后三类β-内酰胺酶之间的几乎没有构象差异，与已获得的晶体结构一致。

二、HDX-MS 揭示 A 类β-内酰胺酶的全局构象

Free state :TEM1的氘吸收程度高于SHV1和PC1;TEM1的骨架酰胺氢的灵活性更高。

Bound state :TEM1氘交换程度降低，表明结合后构象稳定，侧面说明BLIP对TEM1的亲和力可能高于SHV1和PC1。

MD模拟显示TEM1与BLIP结合后RMSD下降，全局稳定性更高，与HDX结果一致。

三、HDX-MS阐明A类β-内酰胺酶关键区域的局部灵活性

三种β-内酰胺酶H10区域都显示出比较高的的氘交换速率，其中TEM1交换速率最快。

TEM1 N端突出环的氘交换程度明显小于SHV1和PC1，反映其结构更加刚性。

TEM1和SHV1的SDNloop和Ωloop的氘交换速率相似，而与PC1差异较大。与TEM1和SHV1的相似底物特异性一致。

四、β-内酰胺酶 TEM1与BLIP的协同结合作用

五、β-内酰胺酶SHV1和PC1与BLIP结合后构象变化的比较

六、设计BLIP突变体以增强抑制

在 BLIP 的 E73 和K74处引入两个突变，E73M和K74G分别与SHV1和PC1的104-106残基特异性偶联。