RNA原位杂交

  近年来，RNA原位杂交技术经由不断地改进，比DNA原位杂交表现出了更广泛的应用前景,本文将会介绍RNA原位杂交技术的原理、详细实验流程以及一些实验注意事项。

1.RNA原位杂交原理

  RNA原位杂交是利用地高辛标记的反义RNA为探针，与切片杂交，从而原位的显示RNA的表达部位和相对丰度。RNA原位杂交是研究基因表达谱的重要方法。

2.RNA原位杂交实验流程

  RNA原位杂交的实验流程分为取材、固定、脱水、包埋、切片、探针合成、杂交，下面就来一一说明。

2.1.取材、固定、脱水、包埋、切片

(1)所有用得到玻璃器皿清洗干净，180°C烘6hrs,载玻片先用95%乙醇浸泡、 擦干净，再180°C烘6hrs;所用的试剂瓶需事先装DEPC·H₂0灭过菌；所用的固定液、乙醇溶液等都要用DEPC·H₂O配制。 　　

(2)固定液配制

  50%FAA适用于幼穗、SAM等幼嫩组织的固定，70%FAA适用于根、茎秆、 叶片等成熟组织的固定。

(3)取材：将所需材料尽量剪小，加入预冷的FAA固定液中，固定液体积应不少于材料体积的10倍。固定液放冰上，抽真空15min，缓慢放气，再重复两次，直到材料沉底。

(4)固定：将抽完真空的固定液吸走弃去，换成新的固定液。4℃固定24hrs。

(5)脱水：如果是用50%FAA固定，先用50%乙醇洗掉固定液，换三次，每次30min；如果是用70%FAA固定，先用70%乙醇洗掉固定液，换三次，每次30min。然后梯度乙醇脱水（4℃）

乙醇溶液	时长
70%乙醇	至少1hr,可过夜，亦可长期保存
85%乙醇	1hr
95%乙醇（含伊红）	至少1hr，推荐过夜

(6)继续脱水和透明（室温）：

溶液	时长
无水乙醇	1hr
无水乙醇	1hr
3/4体积无水乙醇+1/4体积二甲苯	1.5hrs
1/2体积无水乙醇+1/2体积二甲苯	1.5hrs
1/4体积无水乙醇+3/4体积二甲苯	1.5hrs
二甲苯	1hr
二甲苯	1hr

(7)浸蜡：

溶液	温度	时长
二甲苯+碎蜡尽量多	42℃	过夜
每8-12小时，继续补碎蜡	42℃	2-3天
1/2体积二甲苯+1/2体积石蜡	48℃	2hrs
1/4体积二甲苯+3/4体积石蜡	50℃	2hrs
纯蜡	60℃	1hr
纯蜡	60℃	1hr
纯蜡	60℃	1hr
纯蜡	60℃	1hr

(8)包埋：
  预先折好纸盒，并在电磁炉上熔化新的石蜡，置于60℃温箱中备用，注意包埋蜡温度不要过高，以免烫坏组织。包埋时，先铺一层包埋蜡，再将玻璃瓶中的材料倒进纸盒中，镊子稍加热，均匀排列材料（动作尽可能迅速，尤其是包埋蜡之后应尽快进行后续操作）。让材料自然冷却，可第二天再收。蜡块4℃可以保存很久。注意包埋蜡不要倒太多，蜡块厚度以1-2cm为宜，太厚不好切片。 纯蜡的温度可以提升至63度，防止操作过程中不迅速蜡块冷却凝固。

(9)切片前的准备：
  切片盒先用碱水浸泡过夜，然后用DEPC·H₂O洗净，42°C烘干
  用于原位杂交的载玻片必须保证无RNase，我们需要先用95%乙醇浸泡，然后再用干净的手帕擦干，用锡纸包裹后，180°C烘6hrs。如果载玻片本身很干净无浮尘，也可以直接180°C烘6hrs。但是如果载玻片不千净，会影响粘片和封 片。
  烘好后的玻片要涂上0.1% poly-L-lysine溶液。抹片方法：在超净台上，先铺一张干净的A4纸张，将载玻片正面朝上排列成两列摆在纸上（磨砂面方便用铅笔写字，为正面）。在其中一列载玻片中央加20μl poly-L-lysine，然后依次将滴有poly-L-lysine的和无poly-L-lysine的载玻片面对面涂抹均匀，注意不要有气泡，涂完后放置在干净的切片盒中。37℃烘干，至少1hr。

(10)切片：
  切片前，依次用70%乙醇和DEPC·H₂O擦干净切片台面、切片机、展片台。切片厚度一般为8-10μm。展片时，先滴1mlDEPC·H₂O在载玻片上，选取需要的切片漂浮在DEPC·H₂O水滴上。小心将载玻片转移到40℃左右的展片台，待切片展开就用枪吸走DEPC·H₂O，再稍微在展开台的放置，甩掉剩余的DEPC·H₂O，放入切片盒中。注意展片台温度不能过高，否则会产生气泡，破坏切片；展片时间也不能过久，超过5min会导致RNA降解。切好的切片37-42℃烘干1-2天，就可做原位杂交。切好的切片不能放置太久，最好其他步骤都准备好了再切片。

2.2.探针的设计与合成

  探针的设计与合成是整个原位杂交实验的重中之重，往往也是探针设计的不合理导致实验结果的不理想，这边可以参考（RNA原位杂交探针设计与合成实验步骤）

2.3.杂交

  杂交这一步分三天做完，注意事项还是比较多的，这里受篇幅限制，我们另外讲解，请参考（RNA原位杂交实验中杂交步骤详解）

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