RNA原位杂交探针的设计与合成

  前面介绍了RNA原位杂交技术的原理、详细实验流程以及一些实验注意事项。本文将会针对实验流程中探针的设计与合成进行详细说明，欢迎参考。

1.RNA原位杂交探针的设计原则：

a.探针的特异性要好，与其他基因匹配长度不要超过500bp；

b.用于杂交的探针长度为150-200bp，超过此长度的探针需要水解(见本页探针转录的碱水解)，用于转录的模板不要超过1.5kb;

c.探针的GC含最最好在40-60%，没有连续的重复的碱基。

2.探针模板的克隆与线性化；

  将选取的cDNA片段扩增，克隆在含有T7、SP6启动子的载体上，如 P-GEM-T或p-GEM-TEasy载体上。线性化需要用5'突出末端的内切酶，如SalI和NcoI ,酶切的质粒量为20-50μg,酶切体系200μl，酶切时间2hrs至过夜。纯化前，需取1μl酶切产物跑胶检测，确定酶切完全。 　　

  酶切结束，进行纯化，以确保模板没有RNase等杂质。纯化步骤如下：

a. 将酶切体系补水至500μl，向其加入250μl Tris饱和的苯酚和250μl CHCI₃，震荡 5min，12000rpm离心5min.
b. 吸上层水相上清，转移至新管中，加500μl CHCI₃,震荡5min，12000rpm 离心 5min.
c. 吸上清，转移至新管中，加1/10体积的3MNaAc (pH5.2，DEPC·H₂0配），2倍体积的无水乙醇，-20℃冷冻3hrs至过夜。
d. 4℃冷冻离心，12000rpm离心5min.
e.70%乙醇浸洗沉淀，去上清，吹干.
f.加20μl DEPC·H₂0溶解沉淀，测浓度。

3.RNA原位杂交探针的转录：

  探针的转录所用的试剂均用DEPC·H₂0配制，转录的详细步骤如下：

转录体系：

转录体系
线性化的模板	1μg
10xTranscription Buffer	2μl
10xDIG RNA Labeling Mix	2μl
Ribonuclease Inhibitor （TaKaRa）	1μl
T7/SP6 RNA Polymerase	2μl

  补充 DEPC·H₂0 至总体积20μl，37°C转录 2-2.5hrs。

b.DNaseI (invitrogen)2.5μl,37°C处理 15min，去掉DNA模板。
c.加 1pl〇_5MEDTA (pH 8.0)终止反应。
d.加2.5μl 4M LiCl和75μl无水乙醇，-20°C冷冻3hrs至过夜。
e.0℃冷冻离心，12000rpm离心20min。
f.去掉上清，加80%乙醇150μl浸洗，0°C冷冻离心，12000rpm离心20min。
g.小心吸走上清，超净台上吹干，加20-40μl DEPC·H₂0溶解。检测浓度，跑胶检测，-70°C保存。如果转录的探针长度合适，就此完成；如果长度过长，探针不易进入细胞，需要碱水解，继续往下进行。
h.碱水解的时间计算公式如下：
  T=(L_o-L_f)/(KxL_oxL_f)
  L_o:探针初始长度（Kb); L_f:探针终长度（Kb); K: 0.11 Kb/min.
  水解溶液为20μl 100mM NaHC0₃和30μl 100mM Na₂C0₃,加在总体积为100μl。水解温度为60°C，水解时间按上述公式。

i.水解后加入5μl 10%冰乙酸，10μl 3M NaAc，2倍体积的无水乙醇，-20°C 冷冻3hrs至过夜。 j.0℃冷冻离心，12000rpm 离心 20min。 k.去掉上清，加80%乙醇150μl浸洗，0℃冷冻离心，12000rpm离心20min。 l.重复k。 m.小心吸走上清，超净台吹干。溶于20μl DEPC·H₂0,测浓度，跑胶检测。保存于-70°C。

4.RNA原位杂交探针方向的确定：

  用于原位杂交检测的探针是与体内mRNA互补的RNA，称为反义RNA;用于阴性对照的探针是与体内mRNA方向相同的，称为正义RNA。连接入 P-GEM-T或p-GEM-TEasy载体的cdna方向决定了探针的方向。

  此连接方向的话，用Nco I酶切、SP6转录酶转录的探针是反义RNA,用Sal I酶切、T7转录酶转录的探针是正义RNA。如果cDNA连接的方向相反，则探针方向也反过来。

  以上便是RNA原位杂交中探针的设计原则及探针的合成过程，花这些篇幅来介绍，其重要性不言而喻，如果你有什么想法欢迎来与我们交流。

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