rna原位杂交

  本文介绍了rna原位杂交中的杂交这一步的流程，包括试剂配制、注意事项以及三天原位杂交的详细操作步骤，供大家参考。

1.原位杂交试剂配制：

①. 1 M Tris-HCI (pH7.5) 500ml
  Tris base 60.55g,浓盐酸约32ml。加浓盐酸调PH至7.5，定容至500ml.
②. 1 M Tris-HCI (pH 9.5) 300ml
  Tris base 36.33g，浓盐酸1ml。加浓盐酸调pH至9.5,定容至300ml.
③. 0.5M EDTA-2Na pH 8.0 500ml
  EDTA-2Na 93.06g，NaOH约10g,完全溶解后，调pH至8.0,定容于 500ml.
④. 2mg/ml Glycine 500ml
⑤. 1M MgCl₂ 100ml
  MgCl₂.6H₂O 20.331g，定容至 l〇〇ml.
⑥. 5M NaCl 500ml
  NaCl 146.1g，定容至 500ml。
⑦.20×SSPE pH 7.4 1L
  NaCl 175.3g，NaH₂PO₄ 24g,0.5M EDTA(pH 8.0)40ml,定容至1L。
⑧.10×PBS pH 7.4 500ml   NaCl 38g，NaH₂PO₄ 1.8g,Na₂HPO₄ 4.95g,定容至500ml。
⑨：50%硫酸葡聚糖（Detran sulfate）
  Detran sulfate 5g，定容至10ml。分装至1.5ml离心管中，保存于-20℃
（该溶液比较粘稠，我们建议配好后直接按照需要的量1ml分装到10ml的离心管中，放在4度，用的时候直接往离心管中加其他成分。供参考）
⑩.10mg/ml yeast t-RNA 25mg yeat t-RNA（invitrogen），溶于2.5ml DEPC·H₂O中.

注意事项：所有试剂都要用灭菌的DEPC·H₂O配，配试剂用到的量筒需要180℃烘6hrs，a-i在配好后需要灭菌。用时都要在超净台上打开，以免长菌。

2.杂交前的准备：

脱蜡缸、镊子、剪刀等要180℃烘6hrs，切片要37-42℃烘1-2天。10×Blocking solution（3）从-20℃冰箱拿出解冻

原位杂交第一天

3.脱蜡和复水，通风橱中进行：

脱蜡和复水
二甲苯	20min
二甲苯	20min
二甲苯+无水乙醇	2min
无水乙醇	2min
无水乙醇	2min
95%乙醇	2min
85%乙醇	2min
70%乙醇	2min
50%乙醇	2min
30%乙醇	2min
15%乙醇	2min
DEPC·H2O	2min
DEPC·H2O	2min

在脱蜡的同时配制并预热Proteinase K buffer.

Proteinase K buffer(100ml):
1M Tris-HCl(pH7.5)	10ml
0.5M EDTA-2Na(pH8.0)	10ml
DEPC·H2O	80ml

37℃温箱中预热。

4.Proteinase K处理：

  Proteinase K稀释到1μg/ml，37℃处理40min。PBS洗一次，2mg/ml Glycine浸泡2min，再次用PBS洗一次。 　　

　　

5.脱水，用刚才的溶液：

　　

脱水
DEPC·H2O	2min
DEPC·H2O	2min
15%乙醇	2min
30%乙醇	2min
50%乙醇	2min
70%乙醇	2min
85%乙醇	2min
95%乙醇	2min
无水乙醇	2min

超净台上吹干，约30-50min。

6.预杂交：

先配制10×Hybridization salts，可4℃保存.

  吸50%硫酸葡聚糖需要剪去枪头，配制过程尽量不要产生气泡，有气泡需要离心消泡。预杂交液可以-20℃保存。

  预杂交时，取150μl预杂交液滴加在吹干的载玻片上，并用大小合适的干净parafilm覆盖，不能产生气泡。将载玻片转移至离心管盒子中，盒中加DEPC·H₂O,盖严以保湿。42°C预杂交1-3hrs。

7.杂交：

在预杂交液中加入探针，使其浓度为400-1000ng/mL。取下载玻片上的 parafilm,并在面巾纸上吸干,将稀释好的探针滴加150μl于载玻片上，用parafilm 覆盖，放入湿盒中。42°C杂交16-20hrs。

原位杂交第二天，不再需要用DEPC·H₂O配制试剂。

8. 2×SSPE洗三次：
  第一次，揭开parafilm，将玻片浸入2×SSPE中。第二次、第三次，42℃ 15min。

9. 0.2×SSPE洗两次：
  57℃杂交炉中，最小转速，30min，两次。

10. 1×Blocking buffer洗，室温摇床，最小转速，30min.
  1×Blocking buffer(40ml,现配现用)

11. 免疫反应
  配制 BSA washing buffer(200ml,现配现用)
  先将Anti-Digoxigenin-AP 离心 12000rpm 5min，取上清，稀释在BSA washing buffer中，稀释比为1：2500-1：5000，室温杂交2hrs，最小转速摇晃。

12. 洗抗体：
   BSA washing buffer洗三次，每次15min，最小转速摇晃。
   在此期间配制TNM-50 buffer(120ml)

13.TNM-50 buffer洗三次，每次5min。

14.显色反应：
避光配制显色液，30ml TNM-50 buffer中加入0.3-0.8ml NBT/BCIP stock solution，依照具体显色情况，避光显色过夜。

原位杂交第三天

15.待到实验组明显显色而阴性对照没有显色时，将载玻片转移至双蒸水中，洗三次，每次2min。

16.脱水，用原位杂交第一天的溶液：

  因为显出的颜色溶于乙醇，所以脱水的过程要比较快，特别是当显出的颜色比较浅的时候，每一级不要超过10sec.

17.封片，37℃烘干.

18.拍照观察.

以上便是RNA原位杂交中三天杂交的详细操作流程，希望能抛砖引玉，如果你有什么想法欢迎来与我们交流。

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