1.染色体荧光原位杂交原理

    首先.染色体中的目的基因与带有地高辛或生物素标记的互补序列DNA或RNA探针杂交形成较稳定的杂交复合物。接着探针上的地高辛再与连接荧光素的抗地高辛抗体，或生物素再与连接荧光素的抗生物素抗体进行抗原-抗体反应结合。由于标记的荧光素在荧光显微镜下经过不同波长的激发光激发.可发射出不同顔色的荧光，因此，通过荧光素发射出的荧光可检测出目的基因在染色体中的分布位置。下图为地高辛-抗地高辛系统检测原位杂交示意图。

2.仪器设备

(1).温箱       (2).高压灭菌锅
(3).微量加样器 (4).荧光显微镜
(5).显微镜     (6).恒温水浴锅
(7).载玻片、盖玻片 (8).酒精灯
(9).湿盒（取一个大的培养皿，垫几层滤纸，用2×SSC溶液浸湿）

3.试剂

(1).3×PBS（磷酸缓冲液）：390 mmol·L^-1 NaCl、30 mmol·L^-1 Na₂HPO₄和390 mmol·L^-1 NaCl、30 mmol·L^-1 NaH₂PO₄，按1：1混合得到3×PBS，pH7.0，用蒸馏水稀释成1×PBS。
(2).20×SSC（standard saline citrate）：NaCl 175g，柠檬酸三钠88g，用双蒸水溶解，1 mol·L^-1 HCl调节pH为7.0，双蒸水定容至1000mL。其他各级SSC可由贮存液加双蒸水稀释获得。
(3).卡诺固定液：95%乙醇：冰醋酸=3:1。
(4).各级乙醇，45%乙酸，1%醋酸洋红。
(5).70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10 mL水。
(6).50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
(7).杂交液：100%甲酰胺20 μL，50%DS 8μL，20×SSC 4μL，探针4 μL（加前100℃加热标记的探针2min，立即放在冰上冷却，使探针变性），封阻DNA 50倍与探针DNA，10% SDS 2 μL，去离子水定容至40μL。
(8).PI（propidium iodide）/antifade 溶液。
PI原液：先以双蒸水配制溶液，浓度为100μg·mL^-1，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5μg·mL^-1。
antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg·mL^-1，用0.5 mmol·L^-1的NaHCO₃调pH为8.0.取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀。-20℃保存备用。
(9).生物素或地高辛荧光检测试剂盒。
(10).TE（Tris/EDTA）液：10mmol·L^-1 Tris-HCl，1 mmol·L^-1 EDTA，pH8.0。

4.材料

洋葱、蚕豆、大麦、小麦、大豆根尖

5.染色体荧光原位杂交方法步骤

5.1.中期染色体压片的制备
（1）取样：用刀片切下根尖，置于冰水共存的冰瓶中0-3℃处理24h。目的是获得较多中期分列相的细胞。
（2）固定：经预处理的材料冲洗干净后，用卡诺氏固定液20℃固定20h，如果材料不立即进行压片，可置于70%乙醇溶液中待用。
（3）染色：将固定后的材料放入盛有1%醋酸洋红染色液中染色2-4h。
（4）分散与压片：将染色后的根尖放在干净的载玻片上，去掉根冠和伸长区部分，只留2-3 mm长的分生区部分。加1滴 45%乙酸，用镊子将根尖充分压碎，加盖盖玻片。在酒精灯上微加热，稍冷却后，左手食指压紧盖片一个角，右手持解剖针的木柄端敲击盖片，使细胞压平。最后，在该片上垫一滤纸片，用拇指紧压使其更平。
（5）干燥压片：记下分散良心的中期细胞的坐标，并在盖玻片上标记位置后，将载玻片浸入液氮中速冻，再用解剖刀迅速掀掉盖玻片立即浸入95%乙醇中至少5s，空气中干燥。
5.2.探针的制备：按缺口平移DNA标记（Bio-11-dUTP或Dig-11-dUTP）试剂盒操作。
（1）取10μL模板DNA加入一新的离心管中，100℃加热2min，立即转移到冰浴内冷却，12000g离心15min。
（2）倒掉上清液放在冰上，加入下列试剂：
10μL Bio-11-dUTP或Dig-11-dUTP标记的混合dNTP；
5μL DNA聚合酶I；
5μL 新稀释的DNase I（取2μL DNase I加988 μL重蒸水）；
双蒸水加至50μL，短暂离心收集反应液在离心管的底部。
（3）置15℃水浴中2h。
（4）加5μL TE终止反应。
5.3.原位杂交
（1）染色体压片的变性：将染色体压片在60℃烘箱干燥1h后，用RNase A 37℃处理1h，2×SSC漂洗5min，70%去离子甲酰胺70℃变性2-3min，再分别在-20℃预冷的70%、80%、90%、100%乙醇中各脱水5min，空气干燥。
（2）杂交：变形处理后的每张压片加40mL杂交液，覆盖盖玻片后置湿盒中，60℃温浴10min，37℃杂交过夜。
（3）漂洗：2×SSC室温10min，30%去离子甲酰胺37℃ 10min，2×SSC室温10min，1×SSC室温10min，PBS冲洗平衡。
（4）加稀释的兔抗生物素或地高辛抗体40μL，置湿盒中37℃孵育1h。
（5）PBS漂洗4次，每次10min。
（6）加荧光素（FITC）标记的羊抗兔免疫球蛋白溶液，置湿盒中37℃孵育1h。
（7）PBS漂洗4次，每次10min。
（8）用PI/antifade溶液染色2min。
（9）蒸馏水漂洗4次，每次10min。
（10）加盖盖玻片，用无荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察。

6.注意事项

（1）.DNase I的作用是在DNA双链上作用产生缺口，它的浓度和反映的时间长短与标记的探针的长度密切相关，通常以DNA片段约300-500bp为宜。如片段较大，会使探针的渗透性降低，降低杂交率。这时应加适量DNase I继续酶切，直至DNA片段合适后，加5μL TE终止反应；如果DNase I的浓度太大或酶切时间过长会使合成的探针太短，容易产生非特异结合，造成本地增加。因此，最好用8.0 g·L-1 琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳检测标记探针的大小。
（2）.探针与目的DNA的特异性一定要强。
（3）.在制备中期染色体压片时，载玻片一定要洗干净，否则染色体容易掉。

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