1.什么是“超迁移EMSA”？

  超迁移EMSA全称是Super-Shift EMSA，在蛋白质和核酸相互作用后，添加抗体，以检查抗体是否能与蛋白质-DNA或蛋白质-RNA复合物结合，从而产生更大的复合物，并产生更大的位移。这种方法称为超迁移EMSA，移位较大的频带称为超移位频带。

  这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，然后在跑PAGE胶，结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢，这样，从PAGE胶的电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。

2、超迁移EMSA原理？

超移位EMSA的原理很容易理解。抗体与DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合物中的蛋白质（抗原）结合会大大增加其大小，并导致复合物在凝胶中的移动缓慢或停止。

虽然特定蛋白质与靶核酸结合会导致特征性移位，但相对迁移率的变化并不能识别移位复合物中的结合蛋白质是否为目的蛋白。与探针结合的蛋白质的鉴定，通常是通过在结合反应中加入对DNA序列有结合效应的假定蛋白（目的蛋白）的特异性的抗体来完成的。如果感兴趣的蛋白质与目标DNA结合，抗体将与该蛋白质-DNA复合物结合，进一步降低其相对于未结合DNA的流动性，称之为“超移位”。

3.什么时候需要做超迁移EMSA？

常规EMSA后，在这些方面可能需要超迁移EMSA：

（1）确定蛋白质/核酸相互作用的特异性
（2）确定蛋白质/核酸复合物中转录因子家族的激活亚单位。许多转录因子有许多亚单位与不同细胞系或问题中的同一结构域结合。例如，人类NFkB有几个亚单位；p65、p52、p50、c-rel和v-rel。所有这些亚单位都能够绑定到kB域。由于传统的EMSA不能识别蛋白质/核酸复合物中的亚单位，因此超移位EMSA是鉴定EMSA中蛋白质/DNA复合物成分的独特方法。

4.什么样的抗体可以用于超迁移EMSA？

并非所有针对特定转录因子的抗体都可用于超迁移EMSA。与Super Shift EMSA一起使用的抗体应符合以下标准：

（1）识别的结构域抗体应位于蛋白质-核酸复合物的表面；
（2）蛋白质-核酸复合物上的结构域不应与蛋白质-核酸复合物的相互作用区域重叠；
（3）用于蛋白质印迹的抗体不能与超迁移EMSA一起使用，因为抗体只能识别蛋白质的变性prim结构。；
（4）通过注射肽制备的抗体很少可用于超迁移EMSA。

5.如何进行超迁移EMSA？

为了得到超移位EMSA的预期结果，实验应考虑以下几点：

（1） 细胞或组织提取物应具有激活的蛋白质/因子，能够与DNA或RNA探针结合。
（2） 在传统的EMSA中必须检测到蛋白质-核酸复合物的移位带。
（3） 确保抗体能够与蛋白质/核酸复合物中的天然蛋白质结合。
（4） 确保抗体可用于超移位EMSA。
（5） 蛋白质和DNA/RNA反应后，应向反应混合物中添加抗体。
（6） 反应体系中不应有氧化剂。
（7） 用于EMSA的核蛋白用高盐缓冲液分离。较高体积的核提取物可能会阻止抗体与蛋白质/核酸复合物的结合。
（8） 通常，用于超迁移EMSA的抗体浓度远远高于其他免疫分析方法，如Western印迹法或ELISA等。

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