凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术。它在理论上很简单也很迅速，但要成功地进行EMSA，还是有不少需要注意的点。
本文总结了EMSA实验中的4个关键点——优化因素、探针、蛋白、污染，并附参数速查表与常见问题解答，供实验参考。
本文内容速览：
- 一、优化因素——影响实验成败的参数清单
- 二、探针——长度、类型与设计要点
- 三、蛋白——用量、比例与保存
- 四、污染——核酸酶、磷酸酶与色素干扰
- 五、关键参数速查表
- 六、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、优化因素
凝胶迁移实验的过程中需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：
- 抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解）
- 结合蛋白的浓度
- 探针的浓度
- 非特异性探针的浓度
- 缓冲液的配方和pH
- 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件
- 保温时间和温度
- 载体蛋白
- 是否有辅助因子（比如锌或镉等金属离子或激素）
优化原则：以上参数并非孤立调整，而是需要根据结合蛋白来源和探针特点系统优化。建议先固定大部分参数，逐项调整关键变量（如蛋白浓度、缓冲液pH），观察复合物形成效率与特异性。
PART 02二、探针
目的DNA的长度应小于300 bp，以有利于非结合探针和蛋白质-DNA复合物的电泳分离。双链合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。
| 探针类型 | 推荐长度 | 适用场景 |
|---|---|---|
| 短寡核苷酸片段 | 约25 bp | 目的蛋白已被鉴定，结合位点可与其他因子的结合位点区别开 |
| 长限制性酶切片段 | < 300 bp | 对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位 |
长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNase I印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。
探针选择要点：探针长度直接影响复合物与游离探针的分离效果。短探针（约25 bp）分辨率高、特异性强，适合已明确结合位点的验证实验；长片段（<300 bp）信息量大，适合未知结合位点的定位研究。
PART 03三、蛋白
对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白、部分纯化蛋白、粗制核抽提液需作优化。
| 参数 | 推荐范围 | 说明 |
|---|---|---|
| 纯化蛋白用量 | 20–2000 ng | 可将蛋白质:DNA的等摩尔比调整为蛋白质摩尔数是DNA的5倍 |
| 粗制核抽提液用量 | 1–20 μg 蛋白质 | 用于形成特异的复合物 |
| 探针用量 | 50000–200000 cpm 32P-标记探针 | 高特异活性，相当于10–50 fmol DNA探针 |
| 反应体积 | 1–5 μL | — |
- 探针应保存在 -20℃ 以防止降解。
- 在合成或标记后 1–2 个星期内必须使用。
- 无论是探针或是结合蛋白，应避免多次冻融。
PART 04四、污染
污染是EMSA实验中容易被忽视但又极其关键的问题，常见的污染来源包括色素、核酸酶、磷酸酶等。
色素导致复合物解离：加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯蓝和二甲苯蓝的加样样品液。
带型拖尾：当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离；凝胶必须完全聚合，以避免带型拖尾。
复合物不进入凝胶：表明所用的蛋白质或探针过量，或盐的浓度过量，不适用于这一反应。
核酸酶/磷酸酶污染：在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针，表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。
污染控制要点：抽提液制备过程中要严格避免核酸酶和磷酸酶污染，否则会使探针降解；一旦发现污染，需在抽提液中和结合反应中加入相应抑制剂（如RNase抑制剂、磷酸酶抑制剂）。
速查五、关键参数速查表
| 参数 | 推荐范围 / 要求 | 关键提示 |
|---|---|---|
| 探针长度 | < 300 bp（短探针约25 bp） | 有利于非结合探针与复合物分离 |
| 纯化蛋白用量 | 20–2000 ng | 蛋白:DNA摩尔比约 5:1 |
| 粗制核抽提液 | 1–20 μg 蛋白质 | 用于形成特异复合物 |
| 探针用量 | 50000–200000 cpm（32P标记） | 相当于10–50 fmol DNA |
| 反应体积 | 1–5 μL | — |
| 探针保存 | -20℃，合成后1–2周内使用 | 避免反复冻融 |
| 加样样品液 | 不含考马斯蓝、二甲苯蓝 | 避免色素导致复合物解离 |
| 凝胶聚合 | 必须完全聚合 | 避免带型拖尾 |
FAQ六、常见问题解答
Q1：EMSA探针长度多少合适？
目的DNA的长度应小于300 bp，以有利于非结合探针和蛋白质-DNA复合物的电泳分离。如果目的蛋白已被鉴定，应用短的寡核苷酸片段（约25 bp），可与其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。
Q2：EMSA实验中蛋白用量如何控制？
对每一个特定的结合蛋白和探针，所用纯化蛋白、部分纯化蛋白、粗制核抽提液需作优化。一般所用纯化蛋白的量为20–2000 ng，可将蛋白质:DNA的等摩尔比调整为蛋白质摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液时，需要1–20 μg蛋白质形成特异的复合物。
Q3：EMSA条带拖尾或不紧密是怎么回事？
带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离；凝胶必须完全聚合，以避免带型拖尾。此外，加样样品液中的色素（如考马斯蓝、二甲苯蓝）会导致不稳定复合物的解离，应使用不含这些色素的加样样品液。
Q4：EMSA中复合物不进入凝胶怎么办？
如复合物不进入凝胶，则表明所用的蛋白质或探针过量，或盐的浓度过量，不适用于这一反应。需要调整蛋白/探针比例、降低盐浓度，或重新优化缓冲液配方。
Q5：EMSA抽提物被核酸酶或磷酸酶污染怎么判断和处理？
在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针，表明抽提物有核酸或磷酸酶污染。应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂（如RNase抑制剂、磷酸酶抑制剂），并注意制备抽提液时避免核酸酶和磷酸酶污染使探针降解。
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