凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术。凝胶迁移实验在理论上很简单也很迅速，但要成功地进行凝胶迁移实验还是有不少需要注意的点，本文总结了凝胶迁移实验（EMSA）中的4点注意事项，欢迎参考。

一.优化因素

    凝胶迁移实验的过程中需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH，聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否有辅助因子（比如锌或镉等金属离子或激素）。

二.探针

    目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白质-DNA复合物的电泳分离。双链合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp），这样的结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNase I印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。

三.蛋白

对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白、部分纯化蛋白、粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白质：DNA的等摩尔比调整为蛋白质的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20μg蛋白质形成特异的复合物。所加入反应的探针的量是50000-200000cpm³²P-标记的探针（高特异活性），反应体积为1-5μL。这相当于10-50fmol的DNA探针。探针应保存在-20℃以防止降解，在合成或标记后1-2个星期内必须使用。无论是探针或是结合蛋白应避免多次冻融。

四.污染

    加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯蓝和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必须完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白质或探针过量，或盐的浓度过量，不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。

相关服务