实验原理：

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA),蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，出现相对滞后的条带。

凝胶阻滞实验基因原理图

实验目的：

体外分析DNA与特异性蛋白质之间的相互作用。

试剂:

大片段DNA聚合酶(Large Fragment DNA Polymerase I), invitrogen, USA,Cat no. 18012-021

dNTP* (专用)， 由dATP, dTTP, dGTP (Takara, Japon, D4026A, D4027A,D4029A) 1:1:1配制;即各取1μl,再加入497μl灭菌双蒸水混匀

10xM buffer (TaKaRa, CA1401B) (Takara酶切试剂中附带的紫盖buffer)

10xbinding Buffer:
80%甘油62.5ul, 0.1M MgCl 10ul, 5M NaCI 10μl, 1M Tris-HCl (PH=8.0) 10μ,0.5M EDTA2μl, 1M DTT 1μl, ddH2O 4.5ul,至总体积100ul。

电泳缓冲:甘氨酸 (Glycine) 18.8g，Tris 粉3.02g， 加单蒸水定容至1L

10xLoading Buffer (TakaRa, CA2601A) (Takara 酶切试剂中附带)

仪器:

蛋白质分离胶电泳仪(同位素室配置)

操作步骤:

1，制分离胶(6% SDS-PAGE) 8ml 用量		2,标记探针
ddH2O	4.24ml	探针	4μl
30% Acrylamide	1.60ml	dNTP* (专用)	2μl
1.5M Tris-HCl (PH 8.8)	2.00ml	10xM buffer	2μl
10% SDS	0.08ml	大片段DNA聚合酶	1μl
10% AP	0.08ml	ddH2O	9μl
TEMED	0.0064ml	a32pdCTP	2μl
		20μl总体积
		室温40min -1hour,在第3步使用时需补充30ul ddH2O稀释

3，蛋白与探针混合孵育

1)蛋白，核蛋白，3-5μg, 如是纯化蛋白，200-500ng

2)10xbinding Buffer 2ul

3)补ddH₂O至16ul

4)轻弹混匀后低速离心1min

5)在同位素室将稀释后的探针4μl加到4步的离心管管底(同位素室加)，轻弹混匀

6)室温中放置，将探针与DNA混合孵育15-20min

4，点样

1)用20μl小枪分装10xloading buffer 2-3ul到每管管内壁上，作为指示剂

2)用20μl小枪同时吸取内壁指示剂和管底样品进行点样，80-90V 电压电泳约1.5-2.0h

3)压X光片4-5h

用比制胶板略大的两块滤纸将胶卸下，在挡板后用保鲜膜包好，然后压在暗夹内(根据所用同位素信号强弱，新订购回来的同位素时间可以缩短为2-3h)

5，显影

准备三个盆子，左边是显影液，中间是自来水，右边是定影液。在显影液漂洗几秒钟，在中间的水中清洗几秒钟，放在红灯上观察，再定影(时间可以稍长)。

注意事项：

1,指示剂与游离探针的位置相近，最终X光片上需要保留游离探针信号，不能让指示剂跑出去)

2,卸下的两块小玻璃板必须在同位素室有机玻璃挡板后的水龙头上反复冲洗以消除信号，方可带回实验室

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