摘要

  EMSA实验的原理是基于DNA结合蛋白与DNA的特异性结合，依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、突变探针、蛋白特异性抗体等参照物，通过电泳迁移率的变化来进行定性和定量分析。

1、试剂和耗材

样品： Lightshift Chemiluminescent EMSA Kit：Thermo Scientific，货号 20148。

2、主要实验仪器

仪器名称	公司	仪器名称	公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机	美国BECKMAN公司	移液器：2.5 µl/100 µl/200 µl/1000 µl	Eppendorf 公司
Gel Doc2000成像系统、垂直电泳系统	美国BIO-RAD公司	超净工作台	中国苏净集团
AR5120电子天平	美国AHOΜS公司	MultiTemp III 恒温水浴锅 雪花状制冰机	日本SANYO公司

 

3、主要实验仪器

3.1 探针制备

合成生物素标记探针（客户提供序列）：

3.2 电泳

电泳操作视频演示

3.2.1 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制：在 15 ml 试管中，按顺序放入 ddH2O 7.15 ml ，30%聚丙烯酰胺溶液 2 ml，5×TBE 1 ml，甘油 175 μl，10% APS 75 μl， TEMED 8 μl；

3.2.2 4℃，100 V 电压预电泳约 60 min；

3.2.3 根据要求配制结合反应液，室温放置 15 min；

3.2.4 加入生物素标记的探针，室温放置 35 min；

3.2.5 加入 5 μl Loading Buffer 到每一个结合反应中，混匀，上样；

3.2.6 4℃，100 V 电压电泳，至溴芬兰电泳至 2/3 凝胶长度时停止电泳；

3.3 转膜

转膜操作视频演示

3.3.1 将合适大小的尼龙膜浸泡在 0.5×TBE 中 15 min，按照夹心法依次将海绵、 滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、海绵按顺序放好，筛孔板固定，仔细去除夹心内所 有气泡，凝胶面向阴极插入电泳槽中，倒入0.5×TBE，300 mA恒流电转移30 min；

3.3.2 紫外线交联。

3.4 洗膜、信号检测

洗膜操作视频演示

参照 LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit 说明操作。

3.4.1 50℃水浴温和地将封闭缓冲液（blocking buffer）和 4×漂洗缓冲液（Wash Buffer）预热，直至颗粒物全部溶解；

3.4.2 将膜放入洁净的塑料平皿中，加入 20 ml 封闭缓冲液，放在摇床上温和摇 动 15 min；

3.4.3 吸取66.7 μl辣根抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶底物到20 ml封闭缓冲液， 混匀备用；

3.4.4 将封闭缓冲液倒去，加入上一步所配溶液，放在摇床上温和摇动 15min；

3.4.5 取 40 ml 4漂洗缓冲溶液到 120 ml ddH2O 中，得到 1漂洗缓冲溶液；将膜 转移到一个新的塑料平皿，加入 20 ml 1漂洗缓冲溶液漂洗 5min，共漂洗 4 次；

3.4.6 将膜转移至另一新的塑料平皿，加入 30 ml 底物平衡缓冲液，平衡 5min；

3.5.7 配置底物工作液（Substrate Working Solution）：将 6 ml Luminol/Enhancer Solution 加入到 6 ml Stable Peroxide Solution 中，混匀，避光保存备用；

3.4.8 将膜从底物平衡缓冲液中拿出，正面朝上放到新的洁净平皿中，将底物工 作液倒入膜的表面，避光放置 5 min；

3.4.9 将膜从底物工作液中取出，用塑封膜封好，避免气泡和皱褶；

3.4.10 机器曝光并记录结果。

3.5 实验结果

 

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