1.DNA pull down的原理？

DNA pull down的原理是先将含脱硫生物素的DNA pull down探针结合到链霉亲和素Beads上，再将DNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样DNA结合蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将DNA结合蛋白从Beads洗脱下来，得到DNA pull down产物。DNA-protein复合物既可以做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合，又可以做质谱鉴定筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息（如具体某个或某些转录因子/组蛋白等）。

视频讲解

2.DNA pull down能替代酵母单杂交实验吗？它有什么优缺点？

DNA pull down在很多种情况估下可以替代酵母单杂实验，钟小博总结了相对于酵母单杂来说的优缺点：
相对酵母单杂交优势：
(1)、不需要建构建文库，不需要筛选启动子的核心区域，同时，也不需要顾及启动子是不是有自激活，可以直接用DNA的片段作为诱饵进行富集。
(2)、可以直接提取分离核蛋白，利用DNA与核蛋白直接结合，寻找转录因子。避免跟细胞质及亚细胞器中很多结构蛋白的结合，数据更聚焦。
(3)、用液相质谱检测，灵敏度比较高，纳克级别的转录因子都可以被检测到。

相对与酵母单杂实验的劣势
(1)、DNA pull down属于体外结合，体外结合的时候，我们的DNA探针是没办法像体内那样可能实现一些甲基化的修饰的，因此与实际结合状态会有较大差异。
(2)、DNA pull down是选择的是某一个时间点的一个材料。某一个时间点的转录因子的表达情况是极其局限的，有可能存在调控关系的转录因子丰度极低或处于沉默状态。诱饵DNA捕获不到，参考过往大量实际实验数据，大多数实验能捕获的转录因子数量2~10个。
(3)、很多转录因子都是家族类的蛋白，同源性较高。后续用质谱检测，仅凭几个肽段，很难精确锁定转录因子亚型，得到的数据只是算法上的最优结论。

3.DNA pull down的应用背景是什么？

DNA pull-down以感兴趣的DNA序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，最常见的应用是寻找某特定基因启动子区域的转录因子。

启动子通常位于结构基因5'端上游，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。

转录因子也称为反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，它能够与真核基因的顺式作用元件（如启动子、增强子等）特异性结合来激活或抑制基因表达。转录因子有4个主要结构域：DNA结合域决定了转录因子的特异性，转录调控域（包括激活域或抑制域）决定了转录因子的功能，寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用，核定位信号控制转录因子进入细胞核。

一个基因的启动子通常会结合多种转录因子，寻找启动子序列的特异转录因子，有助于我们理解这些启动子下游的功能基因是如何被调控的。

4.DNA pull down探针怎么设计？

DNA pull down的探针长度一般情况下控制在300-4000bp，理想区间为1000-2000bp，之所以如此设计，是因为探针太长或太短都不太好，太短结合的蛋白太少，太长的话，它会存在大量的非特异性结合（整个反应条件里面我们要求是无核酸酶的），尽量避免DNA的序列有非常多的重复结构、或者高GC含量等。

5.DNA Pull down如何设计对照组？

DNA Pull down的对照通常有两种方案，一种方案是选择一个非生物素标记的DNA序列作为对照组，将来拿到的数据，主要是去除根链亲和素的树脂结合的一些蛋白。 第二种方案是使用一个无义的序列，这个需要用生信的方法跟基因组数据比对。 也有对照用LacZ基因作为对照，这个比较多人用，我们有时候也会用GFP的序列，其实就是找一段无关序列。当然，如果为了有一些明确的基因序列需要剔除的话，我们可以用一些其他的基因序列作为对照组来做这个实验。

6.与探针结合的蛋白怎么制备？

做DNA Pull down的蛋白一般有两种，分别是核蛋白与总蛋白，这个有什么区别呢？因为DNA结合的区域，大多数转录因子，我们尽量选取核蛋白来进行，减少杂蛋白的干扰。但是有一些材料，他的细胞核或者和核蛋白非常困难，或者分离我们研究的不是跟转录因子的结合，而是跟组织蛋白或者结构蛋白结合的，这种情况下我们就选用总蛋白。

7.DNA pull down与RNA pull down的差别？

在我们大多数人的潜意识里会认为DNA pull down可能会更简单一点，但实际上RNA成功率更高，结合的蛋白会更多，这是为什么呢？这个地方就取决于我们的探针了，做DNA Pull down的时候，我们的DNA探针是用双链的，大家都知道双链的DNA探针，它会形成一个双螺旋的结构，相对来讲它是比较稳。而RNA是单链的，它会自我形成很多的这种二级结构，我贴了一张二级结构图，在二级结构的基础之上，会形成三级结构，四级结构，它就像有点像是蛋白质。它会形成一个非常复杂的空间结构，这种非常复杂的空间结构相对于DNA的双螺旋链来讲，蛋白质的结合的概率将会大大增加，因此RNA pull down，成功率将会更高一些，当然了，这个事情也不绝对，因为RNA本身不是特别稳定的，我们操作如果说不小心或者是失误的话啊，会出现降解的情况。

8.蛋白拉下来后怎么办？

蛋白拉下来后两种用途，第一种用途就是直接用这个复合物去做Western blot，这种情况下，主要是验证是否含有某一种明确的蛋白，第二种方案呢，我们直接把拉下来的蛋白送去做LC-MS，明确沉淀物中包含哪些蛋白。当然通过第二种方法会得到的数据量比较大。

相关服务